群体感应抑制活性海洋微生物的筛选与抑制因子活性评价

论文摘要

细菌耐药性系指病原菌对于抗菌药物作用的耐受程度,细菌产生对抗生素不敏感的现象。细菌耐药性已成为当今医学研究领域的一个重大难题。病原菌引起人体感染是其自身能够产生多种毒力因子,许多病原菌毒力因子的产生都依赖于细菌群体感应系统的调节和控制,实验证明群体感应系统突变或缺陷的病原菌致病能力显著下降,群体感应抑制因子与传统抗生素的作用机制不同,它不干扰细菌的正常生长,而是直接抑制病原菌的毒力因子的生成,因此,理论上能够缓解细菌耐药性的产生。本研究主要目的是从海洋微生物的次级代谢产物中筛选群体感应抑制因子。本文利用铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群体感应筛选模型PAO MW（IpW-4）和紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）群体感应指示菌株CV026对海洋微生物发酵粗提物进行活性测试,PAO MWI（pW-4）利用群体感应调控基因lasB启动子和缺失启动子的蔗糖致死基因sacB构建而成,外源加入信号分子和蔗糖能够诱导sacB表达杀死细菌,若存在抑制因子致死作用将会得到补救;信号号分子能够诱导CV026产生紫色菌素,若有群体感应抑制因子存在,紫色菌素产量将会降低。经筛选发现1株放线菌和2株真菌粗提物具有群体感应系统抑制活性,其中菌株QY013抑制活性最强,其18S rDNA序列与NCBI数据库比对,发现该菌株与Penicillium decumbens（斜卧青霉）进化距离最近,相似性最高。目前,还没有报道该类青霉种属具有群体感应抑制活性。对菌株QY013进行发酵培养,在其发酵培养液中分离得到活性单体化合物1个,利用核磁（1H NMR,13C NMR）等方法鉴定其为—5,6二氢-4-甲基-2H-吡喃-2-酮,本研究首次证明该吡喃酮类化合物具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统的活性。在不影响细菌生长的浓度范围内,该化合物能显著降低铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应调控的毒力因子,如弹性蛋白酶的活性、绿脓菌素产量,紫色菌素产量,抑制生物被膜的形成; RT-PCR技术证明该化合物能显著降低QS调控相关基因的表达水平。革兰氏阴性菌群体感应信号分子在化学结构上具有一定的相似性,主要差别在于内酯环上的脂肪酸碳链（C）长度和饱和度,根据这种相似性和差别,我们对海洋化合物库中的化合物进行比较,利用筛选模型对18个与信号分子结构相似的化合物进行群体感应抑制活性测试,发现4个化合物具有群体感应抑制活性,编号HD-ZWM-242的化合物为已知化合物青霉酸,该化合物已有报道具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性。编号HD-ZWM-169的化合物能够干扰铜绿假单胞菌和紫色杆菌两种病原菌的群体感应系统,在非抑菌浓度范围内,HD-ZWM-169能够降低铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的活性,绿脓菌素的产量,抑制紫色杆菌紫色菌素的生成,抑制铜绿假单胞菌Swarming运动性,RT-PCR验证该化合物能够降低群体感应调控相关基因的表达。本研究所发现的群体感应抑制因子与传统抗生素类药物作用机理不同,只抑制病原菌群体感应调控的毒力因子,但不会对细菌的正常生长产生选择性压力,理论上能够降低细菌耐药性产生的概率。因此,本研究是一项具有重要理论指导意义的基础研究,为解决细菌耐药性问题提供了新思路,为海洋活性物质的研究与开发引入了新的理念和方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前沿
• 0.1 细菌感染及细菌耐药性研究现状
• 0.2 细菌群体感应系统
• 0.2.1 革兰氏阴性菌群体感应系统
• 0.2.1.1 铜绿假单胞菌群体感应系统
• 0.2.1.2 铜绿假单胞菌感染及其耐药机制
• 0.2.1.3 紫色杆菌群体感应系统
• 0.2.2 革兰氏阳性菌群体感应系统
• 0.2.3 细菌种间群体感应系统
• 0.3 群体感应抑制因子的筛选
• 0.3.1 群体感应抑制因子指示菌株
• 0.3.2 高通量AHL 生物传感器筛选模型及评价
• 0.3.3 计算机模拟辅助药物设计筛选群体感应抑制因子
• 0.4 群体感应抑制因子研究近况
• 0.4.1 天然产物来源
• 0.4.2 小分子化合物库筛选
• 0.5 以细菌群体感应系统为靶标开发新型抗菌药物
• 0.6 本文研究的内容及意义
• 1 海洋微生物的分离培养、活性筛选与种属鉴定
• 1.1 实验材料、试剂及仪器
• 1.1.1 样品来源
• 1.1.2 筛选模型
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 样品采集
• 1.2.2 海洋内共生微生物分离及保藏
• 1.2.3 群体感应抑制因子筛选模型测试方法
• 1.2.4 海洋微生物发酵粗提物制备及活性筛选
• 1.2.5 放线菌基因组DNA 提取
• 1.2.6 真菌基因组DNA 提取
• 1.2.7 TSS 法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞
• 1.2.8 碱裂解法质粒的小量提取制备
• 1.2.9 基于16S rDNA 海洋放线菌的种属鉴定
• 1.2.10 基于18S rDNA 海洋真菌的种属鉴定
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 样品采集
• 1.3.2 海洋放线菌、真菌菌株分离
• 1.3.3 具有群体感应抑制活性海洋放线菌、真菌菌株筛选
• 1.3.4 基于16S rDNA 序列放线菌种属鉴定及系统发育进化树绘制
• 1.3.4.1 放线菌HH-1 基因组DNA 提取
• 1.3.4.2 放线菌HH-1 系统发育进化树绘制
• 1.3.5 海洋真菌种属鉴定及系统发育进化树的绘制
• 1.3.5.1 基于18S rDNA 序列真菌菌株QY010 种属鉴定及系统发育树绘制
• 1.3.5.2 基于18S rDNA 序列真菌菌株QY013 种属鉴定及系统发育树绘制
• 1.4 讨论
• 2 青霉菌 QY013 发酵培养及活性化合物的追踪分离
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株发酵培养及粗提物浸膏的制备
• 2.2.2 群体感应抑制因子的分离纯化
• 2.2.3 筛选模型和薄层层析（TLC）技术追踪活性化合物
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 菌株发酵培养与粗提物浸膏的制备
• 2.3.2 发酵粗提物成分分析
• 2.3.3 群体感应抑制因子分离纯化流程
• 2.3.4 筛选模型和薄层层析（TLC）技术追踪活性化合物
• 2.3.5 化合物结构鉴定
• 2.4 讨论
• 3 活性化合物抗群体感应生物活性检测及评价
• 3.1 实验材料、试剂及仪器
• 3.1.1 实验材料、试剂
• 3.1.2 筛选模型
• 3.1.3 培养基及常用缓冲液
• 3.1.4 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 铜绿假单胞菌生长曲线测试
• 3.2.2 铜绿假单胞菌毒力因子检测方法
• 3.2.3 铜绿假单胞菌群体感应调控相关基因表达的检测（RT-PCR）
• 3.2.4 铜绿假单胞菌Swarming 运动检测
• 3.2.5 紫色杆菌生长曲线测试
• 3.2.6 紫色杆菌紫色菌素产量检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 化合物MB-YWG-04 对铜绿假单胞菌生长影响
• 3.3.2 化合物MB-YWG-04 对铜绿假单胞菌毒力因子的影响
• 3.3.3 化合物MB-YWG-04 对铜绿假单胞菌群体感应调控基因表达的影响
• 3.3.4 化合物MB-YWG-04 对铜绿假单胞菌Swarming 运动影响
• 3.3.5 化合物MB-YWG-04 对紫色杆菌生长影响
• 3.3.6 化合物MB-YWG-04 对紫色杆菌紫色菌素产量影响
• 3.3.7 化合物MB-YWG-04 对紫色杆菌群体感应调控基因表达的影响
• 3.4 讨论
• 4 海洋化合物库中群体感应抑制因子筛选
• 4.1 实验材料、试剂及仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 筛选模型
• 4.1.3 培养基及缓冲液
• 4.1.4 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 海洋化合物库群体感应抑制因子筛选
• 4.2.2 细菌生长曲线检测
• 4.2.3 铜绿假单胞菌毒力因子检测
• 4.2.4 铜绿假单胞菌Swarming 运动检测
• 4.2.5 紫色杆菌紫色菌素产量测定
• 4.2.6 铜绿假单胞菌群体感应调控毒力基因表达的检测（RT-PCR）
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 具有QS 抑制活性单体化合物的筛选
• 4.3.2 化合物HD-ZWM-169 对细菌生长影响
• 4.3.3 化合物HD-ZWM-169 对于铜绿假单胞菌毒力因子的影响
• 4.3.4 化合物HD-ZWM-169 对铜绿假单胞菌Swarming 运动影响
• 4.3.5 化合物 HD-ZWM-169 对于紫色杆菌紫色菌素产量影响
• 4.3.6 化合物 HD-ZWM-169 对于铜绿假单胞菌群体感应调控基因表达的影响
• 4.4 讨论
• 5 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
• 本人概况
• 参加会议
• 发表文章
• 申请专利