栉孔扇贝免疫致敏（immune priming）现象及其机制的初步研究

论文摘要

栉孔扇贝是我国重要的海水养殖品种,自1997年以来陆续爆发的大规模死亡,不仅造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。本研究通过比较扇贝在连续刺激条件下的不同免疫反应,推测栉孔扇贝中有无免疫致敏和记忆现象,观察短期免疫刺激对扇贝再次遇到相同病原物刺激时死亡率的影响,探讨栉孔扇贝的免疫致敏作用,并对其机制进行初步探讨,以期更好地了解扇贝的免疫防御机制,为扇贝病害防治提供参考。利用荧光实时定量PCR技术检测了扇贝受到鳗弧菌连续等量刺激后两种重要病原识别受体（PRR）基因的表达。结果显示,在受到连续两次刺激后CfPGRP-S1、LGBP基因的表达量均有不同程度的增加。其中CfPGRP-S1基因在受到第二次刺激后表达量增加的幅度高于第一次,且基因表达显著性增加的时间比第一次提前;LGBP基因在第二次刺激后,表达量显著性增加的时间也比第一次提前。同时,对同批处理的扇贝进行重要免疫指标的检测分析发现两次刺激后吞噬率变化不显著,而第二次刺激后吞噬指数的最大峰值高于第一次,并且最大峰值出现的时间比第一次提前;血淋巴中的抗菌活力和肝胰腺中SOD、MDA含量在两次刺激前后的变化不显著。在脊椎动物中,识别能力和抗菌能力的提高是免疫记忆的两个重要特点,栉孔扇贝在第二次免疫刺激后PRR识别能力的提高和吞噬作用的增强,说明扇贝中可能存在类似脊椎动物免疫记忆的免疫致敏作用。对扇贝进行两次鳗弧菌浸泡刺激,第一次为短期浸泡刺激,第二次为长期浸泡刺激。结果发现,第一次浸泡过的扇贝在遭受相同病原第二次刺激时,在一定时间段内其死亡率比未受第一次刺激的扇贝极显著降低,表明第一次的短期病原刺激增强了扇贝对第二次刺激的抵抗能力。同时比较第二次刺激过程中扇贝免疫指标的变化发现经过短期刺激扇贝的吞噬作用、ACP和AKP活性比未受过刺激的扇贝显著增强,而其他指标包括POL、SOD则差异不显著,说明增强的吞噬作用、ACP和AKP活性与扇贝的死亡率下降有关。研究结果表明栉孔扇贝中存在免疫致敏（immune priming）现象,短期刺激可以提高扇贝的免疫反应能力,增强扇贝机体对相同病原物的抵抗能力。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 一、栉孔扇贝养殖现状及面临问题
• 1.栉孔扇贝养殖
• 2.栉孔扇贝养殖面临问题
• 3.病害控制策略
• 3.1 抗生素的使用
• 3.2 免疫增强剂的应用
• 二、无脊椎动物免疫防御机制
• 1.无脊椎动物免疫防御与脊椎动物免疫防御的差异
• 2.固有免疫防御机制
• 2.1 细胞免疫
• 2.1.1 吞噬作用
• 2.1.1.1 吞噬细胞的识别
• 2.1.1.2 病原物的吞入及其杀灭机制
• 2.2 体液免疫
• 2.2.1 水解酶类
• 2.2.2 氧化酶
• 2.2.3 抗氧化酶类
• 三、无脊椎动物免疫致敏（immune priming）研究
• 1.脊椎动物的免疫记忆研究
• 2.无脊椎动物的免疫致敏（immune priming）研究
• 2.1 无脊椎动物中存在免疫记忆现象
• 2.1.1 海绵动物组织移植中的排斥现象
• 2.1.2 昆虫类及甲壳类动物中的免疫记忆现象
• 2.2 无脊椎动物可能产生特异性免疫致敏（immune priming）的机制
• 2.2.1 无特异性的可诱导机制组合型表达时可以产生特异性免疫致敏
• 2.2.2 免疫成分的协作效应可能产生特异性免疫致敏
• 2.2.3 免疫成分的剂量效应可能产生特异性免疫致敏
• 2.3 无脊椎动物免疫致敏在进化上的重要性
• 2.4 目前无脊椎动物免疫致敏研究缺少理论支持
• 2.5 研究无脊椎动物在第二次受到相同病原物刺激后的免疫反应将为无脊椎动物免疫致敏研究提供宝贵的理论数据支持
• 四、本研究的目的和意义
• 1.本研究的目的
• 2.本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 一、材料
• 1.扇贝
• 1.1 注射刺激
• 1.1.1 菌刺激
• 1.1.2 取样
• 1.2 浸泡刺激
• 1.2.1 扇贝和鳗弧菌
• 1.2.2 菌刺激与取样
• 2.培养基
• 3.菌株
• 4.主要化学试剂与仪器设备
• 4.1 主要化学试剂
• 4.2 主要仪器设备
• 二、方法
• 1.扇贝总RNA提取和cDNA模板第一链的合成
• 1.1 扇贝总RNA提取
• 1.1.1 实验用品的预处理
• 1.1.2 扇贝总RNA提取
• 1.1.3 DNase I消化
• 1.2 扇贝cDNA模板第一链的合成
• 2.荧光实时定量PCR检测目的基因的表达
• 2.1 荧光实时定量PCR的原理
• 2.2 荧光实时定量PCR的引物设计
• 2.3 荧光实时定量PCR检测环境胁迫下目的基因的表达
• 2.4 荧光实时定量PCR反应体系及参数
• 3.栉孔扇贝体液免疫指标的测定
• 3.1 样品制备
• 3.2 吞噬活性的测定
• 3.3 POL活性的测定
• 3.4 抗菌活力的测定
• 3.5 ACP和活性的测定
• 3.6 AKP活性的测定
• 3.7 SOD活性的测定
• 3.8 MDA含量的测定
• 4.数据分析
• 第三章 结果
• 一.扇贝在连续接受等量鳗弧菌刺激后PRR（CfPGRP-S1和LGBP）及各种免疫指标的变化
• 1.实时定量PCR检测栉孔扇贝受到鳗弧菌刺激后CfPGRP-S1和LGBP的时序表达
• 1.1 鳗弧菌刺激后CfPGRP-S1基因的时序表达
• 1.2 鳗弧菌刺激后LGBP基因的时序表达
• 2.鳗弧菌刺激后各免疫指标的变化
• 2.1.吞噬活性的变化
• 2.2 血淋巴中抗菌活力的变化
• 2.3 肝胰腺中酶活性的变化
• 2.3.1 SOD活性的变化
• 2.3.2 MDA含量的变化
• 二.扇贝在连续接受两次浸泡刺激后死亡率及各种免疫指标变化情况的研究
• 1.鳗弧菌刺激浓度的确定
• 2.短期刺激后扇贝各种免疫指标的变化
• 3.第二次浸泡刺激中各组的死亡率变化
• 4.第二次浸泡刺激中各组的免疫指标的变化
• 第四章 讨论
• 一.扇贝中有可能存在免疫致敏（immune priming）现象
• 二.扇贝中存在增强的免疫保护作用
• 三.并非所有免疫成分都参与扇贝增强的免疫保护作用
• 四.无脊椎动物免疫致敏（immune priming）机制的复杂性和未知性
• 第五章 结论
• 第六章 栉孔扇贝过氧化物还原酶（Peroxiredoxin）基因cDNA序列分析及其在短期鳗弧菌刺激下的表达
• 参考文献
• 博士期间完成及发表的文章
• 致谢