甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能的研究

论文摘要

甜菜M14品系是二倍体栽培甜菜与野生白花甜菜杂交及回交得到附加有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系。经鉴定甜菜M14品系具有耐盐、耐寒、耐旱、无融合生殖等抗性,推测甜菜M14品系所表现出来的优良性状可能与第9号染色体有关。前期的工作中,实验室以甜菜M14品系为材料,栽培甜菜为对照,共获得了差异表达的ESTs共298个,差异表达蛋白71个。通过比对得到8在蛋白质水平及转录组水平均差异表达的蛋白质。本试验研究的甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（3vM14-CCoAOMT）就是其中之一。前期工作表明,与二倍体栽培甜菜相比,该蛋白在甜菜M14品系中上调表达2.06倍。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素合成的关键甲基转移酶之一,对植物的生长发育具有重要的作用,多数的报道称CCoAOMT基因与植物的防御机制有关,随后发现CCoAOMT基因的表达同样受环境因子的诱导,植物在干旱和高盐胁迫下,有CCoAOMT基因表达增强的现象。本试验是基于实验室的前期工作基础之上,克隆出甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因,对该基因在提高木质素含量及对非生物胁迫抗性方面进行深入研究。首先,利用RACE技术获得了BvM14-CCoAOMT基因cDNA全长,共计1107bp。通过ORF分析,该序列包含最大完整的读码框为714bp,编码237个氨基酸,序列分析表示该蛋白有多个SAM结合位点及甲基转移酶家族高度保守残基；通过实时荧光定量PCR对BvM14-CCoAOMT基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花组织中的表达情况进行了分析,结果显示该基因在植物体的各个组织中均有表达,并且在茎中的表达量最高。其次,构建了BvM14-CCoAOMT基因的原核表达载体,在0.5mmol/L IPTG、37℃的诱导条件下BvM14-CCoAOMT蛋白的表达量最大；Western Blot结果呈现阳性,说明BvM14-CCoAOMT融合蛋白能够正确表达。以转空质粒的菌株作为对照,对转BvM14-CCoAOMT基因的BL21（DE3）菌体蛋白进行酶活力测定,说明菌体蛋白具有CCoAOMT酶活性。再次,构建了pCAMBIA1300-BvM14-CCoAOMT-gpf融合表达载体,在烟草瞬时表达,亚细胞定位结果显示BVM14-CCoAOMT-gfp融合蛋白定位在烟草细胞的细胞质中。最后,构建了BvM14-CCoAOMT基因的真核表达载体,并转化到模式植物烟草当中使其过量表达,对To代转基因植株进行了木质素含量的测定及底物酶活力的测定。对T1代阳性转基因幼苗在NaCl和甘露醇胁迫下对幼苗的表型进行测定。生理指标方面进行了叶绿素含量测定、质膜透性测定、木质素含量的测定及酶活力的测定,结果显示转BvM14-CCoAOMT基因的植株要比野生型植株好的多。以上结果证实甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因的过量表达能够提高烟草对干旱、高盐胁迫的抗性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 甜菜M14品系的特点及其研究现状
• 1.1.1 甜菜M14品系的获得
• 1.1.2 甜菜M14品系研究进展
• 1.2 植物咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的研究进展
• 1.2.1 木质素的作用及以咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的关系
• 1.2.2 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的研究进展
• 1.2.3 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的功能
• 1.3 cDNA末端快速扩增技术
• 1.3.1 经典RACE技术介绍
• 1.3.2 SMART RACE技术的优势
• 1.4 实时荧光定量PCR的介绍
• 1.4.1 实时荧光定量PCR的简介
• 1.4.2 实时荧光定量PCR的原理
• 1.4.3 两种应用广泛的实时荧光定量PCR标记方法的介绍
• 1.5 本试验的研究内容及意义
• 1.6 本试验技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒载体
• 2.1.3 试剂及试剂盒
• 2.1.4 试验所需常用试剂、培养基
• 2.1.5 试验所需引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因全长的获得
• 2.2.2 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因组织表达分析
• 2.2.3 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因原核表达体系研究
• 2.2.4 BvM14-CCoAOMT基因在烟草中过量表达及功能鉴定
• 2.2.5 BvM14-CCoAOMT蛋白的亚细胞定位
• 第3章 结果与分析
• 3.1 甜菜M14品系BvMl4-CCoAOMT基因cDNA全长的获得
• 3.1.1 甜菜M14品系根、茎、叶、花RNA的获得
• 3.1.2 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因3’末端的获得
• 3.1.3 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因5’末端的获得
• 3.1.4 BvM14-CCoAOMT基因全长的RT-PCR验证
• 3.2 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因的生物信息学分析
• 3.2.1 BvM14-CCoAOMT基因全长的序列分析
• 3.2.2 BvM14-CCoAOMT蛋白多重序列比对
• 3.2.3 BvM14-CCoAOMT蛋白的系统发育分析
• 3.3 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因组织表达分析
• 3.3.1 BvM14-CCoAOMT基因实时荧光定量PCR特异性扩增效率的分析
• 3.3.2 BvM14-CCoAOMT基因实时荧光定量PCR产物特异性检测
• 3.3.3 BvM14-CCoAOMT基因的组织特异表达定量分析
• 3.3.4 BvM14-CCoAOMT基因组织特异性表达结果验证
• 3.4 BvM14-CCoAOMT基因原核表达体系的研究
• 3.4.1 原核表达载体pET28a-BvM14-CCoAOMT的构建
• 3.4.2 BvM14-CCoAOMT蛋白的原核诱导表达
• 3.4.3 原核表达的BvM14-CCoAOMT融合蛋白的Western Blot鉴定
• 3.4.4 原核表达的BvM14-CCoAOMT酶活力的测定
• 3.5 BvM14-CCoAOMT基因在烟草中过量表达及功能鉴定
• 3.5.1 真核表达载体pBI121-BvM14-CCoAOMT的构建
• 3.5.2 植物表达载体pBI121-BvM14-CCoAOMT转化农杆菌
• 0代转基因烟草植株'>3.5.3 利用叶盘侵染法获得T₀代转基因烟草植株
• 0代转基因烟草植株的分子生物学检测'>3.5.4 T₀代转基因烟草植株的分子生物学检测
• 1代转基因烟草抗性鉴定'>3.5.5 T₁代转基因烟草抗性鉴定
• 3.6 BvM14-CCoAOMT蛋白的亚细胞定位
• 3.6.1 表达载体pCAMBIA1300-BvM14-CCoAOMT-gfp的获得
• 第4章 讨论
• 4.1 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因5’末端的获得
• 4.2 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因组织特异性表达分析
• 4.3 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因与木质素含量的关系
• 4.4 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT基因提高转基因植物的耐盐和耐旱性
• 4.5 甜菜M14品系BvM14-CCoAOMT蛋白的亚细胞定位分析
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位论文期间发表的学术论文