论文摘要
研究背景及目的：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病以明显的区域分布、强烈的转移倾向、与EB病毒的密切关系为显著特征。放射治疗是鼻咽癌目前公认和有效的治疗手段,但因其严重的并发症及后遗症,治疗效果并不稳定,5年总生存率始终徘徊在50%左右。因此,探究鼻咽癌发病的分子机制,寻找新的治疗靶点,提高现有治疗手段的疗效,是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。COX-2是环氧合酶两种同工酶的其中一种,在体内呈诱导性表达,在大多数正常组织中难以发现。当受到一些刺激因子如生长因子、细胞因子及促癌剂的刺激时,其表达量会成倍增加。抑制COX-2的表达可明显增加化疗及放疗对鼻咽癌细胞的杀伤能力。shRNAmir（microRNA-adapted,shRNA）是在microRNA结构基础上改造出的发夹状小干扰RNA,利用shRNAmir表达载体,在细胞内转录出与miRNA相似的shRNAmir,比传统的shRNA更加安全有效,是人工诱导RNA干扰沉默基因表达的最新技术。本课题前期已完成如下研究工作：应用RNA干扰技术沉默COX-2的表达,使得鼻咽癌细胞周期出现G0/G1期阻滞,且增殖能力明显下降；应用基于miR-155结构的RNA干扰技术,成功构建了Anti-COX-2 shRNAmir（?）慢病毒表达载体,经慢病毒感染48-72h后,阳性C666-1细胞发出绿色萤光,感染效率最高达90.5%,经流式细胞仪分选出带荧光的细胞经连续传代3个月后,带光率仍超99%,RT-PCR几乎检测不到COX-2基因mRNA的表达,获得了稳定抑制COX-2表达的鼻咽癌细胞亚系,证明shRNAmir慢病毒载体具备获得稳定持久的RNA干扰作用,在转录后水平沉默COX-2基因,达到了“基因敲除”的效果,远优于Anti-COX-2 siRNA的干扰效果,应用于鼻咽癌分子机制研究,为下一步的分子靶向治疗和基因-放射联合治疗奠定基础。在前期研究工作的基础上,本研究进一步探讨COX-2基因沉默后对鼻咽癌细胞生长、转移及对放化疗敏感性的影响,为鼻咽癌患者的综合治疗提供理论依据。方法1.检测COX-2沉默后对鼻咽癌细胞生长特性的影响2×103个指数生长期细胞接种于96孔板中,每孔细胞悬液量为100ul,置于培养箱中分别培养1、2、3、4、5天,向每孔加入10ul的CCK-8溶液,将培养板置于培养箱中孵育1h,用酶标仪测定在450nm处的OD值,以相对应OD值表示细胞增殖能力大小。每组设6个重复孔,取平均值,绘制体外生长曲线。2.划痕实验2×105个细胞接种于6孔板,每组细胞作3个复孔,待细胞长至约90%汇合时,吸干培养基,用200ul tip头垂直在培养孔中部轻轻划过,力度以刮落细胞而不在培养板上留痕为准。PBS洗2遍以冲去脱落细胞,加入培养基后继续培养。每个孔随机选取9个有划痕穿过的视野,分别观察0h,6h,12h,24h时细胞细胞划痕处细胞运动变化,并拍照取样,应用Image J软件测划痕相对宽度,绘制迁移力量值曲线,独立实验重复3次。3.检测COX-2沉默后鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性变化两组细胞分别按5000个/孔加入96孔板中,每孔加入培养基100ul,培养24h后弃去培养基,加入含有不同浓度顺铂的培养基,使其终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32ug/ml,每组3个复孔,并设不接种细胞的空白培养基调零组和加入等体积溶剂的对照组,作用24h后加入10ul CCK-8试剂,置于培养箱中孵育1h后,利用酶标仪测各孔450nm处的吸光度A450,计算细胞生长的抑制率,并应用SPSS13.0软件计算半数抑制浓度。4.细胞周期实验指数生长期细胞在含有6ug/ml的顺铂或不含顺铂的培养基中培养24h,或经2Gy照射或0Gy假照射24及48h后,以不含EDTA的胰酶消化后收集细胞,加入70%冰乙醇中4℃过夜,PBS洗涤2遍后,避光加入含有50ug/ml的RNA酶和50ul/ml PI的染色液中,室温染色30min后,流式细胞仪检测细胞周期各时相所占百分比。5.克隆形成实验两组细胞按预定数量接种于6孔板中,每组均设0、1、2、4、6、8Gy六个剂量组,每一剂量组3个复孔。照射后的细胞置于37℃、5%CO2培养箱内培养。当出现肉眼可见克隆时,终止培养,甲醇固定,1%结晶紫乙醇溶液染色。显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率和存活分数。以3次照射的存活分数均值进行分析,运用GraphPad Prism 5.0软件进行L-Q模型和多靶单击模型曲线拟合,绘制剂量存活曲线,并计算L-Q模型参数α、β、α/β、SF2和多靶单击模型参数D0、Dq、和N,其中logN=Dq/D0,计算放射增敏比。6.体内放疗敏感性实验雌性BALB/c裸鼠,4-6周龄,18～22g, SPF条件下饲养。将两组细胞分别制成单细胞悬液,用无血清1640培养基调节细胞浓度至1×106/ml。在裸鼠右后肢皮下接种细胞悬液0.1ml,实验中每2天用游标卡尺测量肿瘤的最大径和与之垂直的横径,肿瘤体积（V）=（长径×短径2）/2。10-14d后,当肿瘤体积达到约200mm3时,将荷瘤裸鼠分为4组：①COX-2（+）对照组,无任何处理；②COX-2（-）对照组,无任何处理；③COX-2（+）实验组,给予10GyX线照射；④COX-2（-）实验组,给予10Gy X线照射。每组6只,2周后断颈处死裸鼠,计算抑瘤率。7.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差表示,两样本均数的比较才采用完全随机设计资料的方差分析（One-Way ANOVA）或两独立样本的t检验（Independent-Sample T Test）。增殖实验和划痕实验采用析因设计的方差分析,多重比较采用SNK法（Student-Neuman-Keuls）, P<0.05表示差异有统计学意义。结果：1.COX-2基因沉默后对鼻咽癌细胞增殖和体外迁移能力的影响Anti-COX-2 C666-1和Anti-GL-2 C666-1细胞,接种96孔板连续观察5天,依据450nm处OD值绘制生长曲线,析因分析结果表明,两种细胞增殖差异有统计学意义（F=5.927,P=0.019）,但细胞组别与天数之间无交互效应（F=1.264,P=0.296）,说明COX-2基因沉默后细胞增殖能力有所下降,但两组细胞增殖速度随时间变化趋势相同。细胞划痕实验检测COX-2稳定沉默后对鼻咽癌细胞C666-1体外迁移能力的影响,析因设计的方差分析结果显示,随着培养时间的延长,两组间划痕宽度差异有统计学意义（F=157.01,P<0.001）,细胞组别与时间之间有交互效应（F=15.73,P<0.001）,说明随着时间的变化,两组细胞体外迁移距离的变化趋势不同,Anti-COX-2 C666-1细胞迁移能力较Anti-GL-2 C666-1有所减弱。2.COX-2沉默后鼻咽癌C666-1细胞对顺铂敏感性的变化析因分析结果显示,不同浓度顺铂作用24h后,两组细胞增殖抑制率差异有统计学意义（F=22.219,P<0.001）,经计算得出Anti-COX-2 C666-1和Anti-GL-2C666-1细胞对顺铂的IC50分别为3.682±0.980和8.819±2.354,两组间IC50差异有统计学意义（t=-3.489,P=0.025）。3.COX-2沉默后对顺铂引起细胞周期变化的影响流式细胞仪分析结果表明,加顺铂前Anti-COX-2 C666-1和Anti-GL-2C666-1细胞周期中,G0/G1期细胞比例分别为70.260%和60.353%（t=-2.726,P=0.053）,S期细胞比例分别为24.270%和32.180%（t=-2.033,P=0.112）,差异均无统计学意义,G2/M期细胞比例差别有统计学意义,分别为5.470%和7.500%（t=-3.954, P=0.017）。6ug/ml的顺铂作用24h后,两组细胞S期与G2/M期比例均升高,两组均出现S期和G2/M期阻滞,S期比例升高幅度分别为24.967%和32.200%,两组间差异无统计学意义（t=--1.636,P=0.177）,G2/M期比例升高幅度分别为0.500%和7.633%,两组间差异有统计学意义（t=-7.501,P=0.002）。COX-2沉默后G2/M期升高比例减少。但顺铂作用前后均未出现明显的凋亡峰,说明COX-2沉默后降低了顺铂引起的细胞G2/M期阻滞,但对细胞凋亡无明显影响。4.COX-2沉默后对鼻咽癌C666-1细胞体外放疗敏感性的影响COX-2沉默前后Do值分别为2.0157±0.0515、1.6333±0.0751,Dq值分别为0.8037±0.0487、0.5643±0.0399,SF2分别为0.5551±0.0375、0.3961±0.0160,α/β分别为6.5356±0.8461、9.4231±0.9599,两组间D0、Dq、F2、α/β值差异均有统计学意义,放射增敏比SER=1.4014。5.COX-2沉默后对辐射引起细胞周期的影响流式细胞仪分析结果表明,照射前Anti-GL-2 C666-1和Anti-COX-2 C666-1细胞周期中,G0/G1以及S期细胞比例差异均无统计学意义,但G2/M期细胞比例差别有统计学意义,分别为7.500%和5.470%（t=-3.952,P=0.017）。照射2Gy后24h,G2期细胞比例均增高,分别为45.833%和23.900%（t=11.999,P<0.001）,两组细胞均出现G2/M期阻滞,但Anti-GL-2 C666-1细胞G2/M期升高比例更大,为38.333%,而Anti-COX-2 C666-2细胞G2/M期比例升高18.430%（t=9.184,P=0.001）。照射2Gy后48h,两组细胞G2/M期的比例分别为24.397%和12.393%（t=4.646,P=0.01）,较照射前分别增加了17.357%和6.923%（t=3.320,P=0.029）。但照射前后均未出现反映细胞凋亡的亚G1期（sub-G1 phase）,说明COX-2沉默后显著降低了辐射引起的细胞G2/M期阻滞,但对细胞凋亡无明显影响。6.COX-2沉默后对体内荷瘤裸鼠辐射敏感性的影响未放疗组,Anti-GL-2和Anti-COX-2两组裸鼠移植瘤生长曲线几乎重合,COX-2沉默前后对皮下移植瘤的生长情况差异无统计学意义（F=3.061,P=0.084）,加入10Gy单纯放疗后,Anti-GL-2和Anti-COX-2两组的抑瘤率分别为32.72%和51.76%,两组间皮下移植瘤的生长情况差异有统计学意义（F=63.468,P<0.001）。结论：1.COX-2沉默后降低了鼻咽癌细胞的增殖及体外迁移能力；2.COX-2沉默后增强顺铂对鼻咽癌C666-1细胞的敏感性,降低了顺铂引起的细胞G2/M期阻滞；3.COX-2沉默后增强鼻咽癌体内外放疗的敏感性,降低了辐射引起的细胞G2/M期阻滞。