绢丝昆虫柳蚕卵黄原蛋白（Vg）cDNA的克隆及序列分析

论文摘要

本论文主要是对柳蚕卵黄原蛋白基因cDNA的克隆和序列分析。柳蚕（Actias selene Hubner）是属于鳞翅目（Lepidoptera）大蚕蛾科（Saturniidae）的一种野生绢丝昆虫,国内外对其相关研究较少,通过SDS-PAGE和Westernblotting鉴定了柳蚕的卵黄原蛋白是由大小两个亚基组成,分子量分别为175kD和45kD,存在组织、时期、性别表达的差异性。利用昆虫卵黄原蛋白进化上的保守性,根据已经解析出的家蚕、天蚕、柞蚕、蓖麻蚕、樟蚕、野桑蚕、樗蚕卵黄原蛋白cDNA序列设计4对特异性引物对柳蚕的总RNA进行RT-PCR扩增,分别得到4条大小分别为1000bp、1000bp、2200bp、1700bp左右的cDNA片段;对于3’-end进行RACE扩增,得到了1条750bp左右的cDNA片段,因cDNA片段的重叠性好,从而解析出柳蚕卵黄原蛋白cDNA的全序列。该序列含有5701碱基,由一个ORF组成,编码1774个氨基酸,卵黄原蛋白的氨基酸序列和cDNA序列与樟蚕、天蚕、柞蚕、野桑蚕、家蚕、樗蚕、蓖麻蚕的同源性分别为83.1%、81.1%、81.0%、64.7%、64.6%、79.7%、79.2%和82.5%、82.6%、82.7%、60.2%、60.4%、79.8%、79.9%。含有特定的酶切识别位点RSRR,卵黄原蛋白前体被酶切为大小两个亚基,根据氨基酸推算的相对分子质量分别为161.565KD和39.654KD,如果考虑到翻译后的修饰,这与SDS-PAGE鉴定的结果是吻合的。该序列含有两个多聚丝氨酸区,分别在切割位点前14个和后24个氨基酸处,DGQR和GICG分别出现在第1573和1590氨基酸处,C末端含有6个保守的半胱氨酸。根据已经解析的8种绢丝昆虫卵黄原蛋白的氨基酸序列构建了系统树,结果证明了昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有很好的保守性。柳蚕卵黄原蛋白cDNA序列已登录GeneBank,登录号为EF523567。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 一 绪论
• 1.1 昆虫卵黄原蛋白概述
• 1.2 昆虫卵黄原蛋白（Vg）的性质和结构
• 1.3 昆虫卵黄原蛋白（Vg）基因结构
• 1.4 昆虫卵黄原蛋白的合成及影响因子
• 1.5 昆虫卵黄原蛋白的摄取及调控
• 1.6 昆虫卵黄蛋白的降解及调控
• 1.7 卵黄蛋白研究的目的和意义
• 1.8 卵黄蛋白研究的基本技术路线
• 二 材料和方法
• 2.1 供试材料
• 2.2 主要的仪器设备
• 2.3 主要生化试剂及常用溶液的配制
• 2.4 脂肪体的提取
• 2.5 脂肪体总RNA的抽提
• 2.6 总RNA的检测
• 2.7 RT-PCR成分及程序
• 2.8 反转录及3'RACE方法克隆柳蚕卵黄原蛋白cDNA
• 2.9 RT-PCR产物的纯化
• 2.10 感受态细胞的制备
• 2.11 连接和转化
• 2.12 质粒DNA的制备
• 2.13 重组质粒的检测
• 2.14 测序
• 2.15 序列拼接与分析
• 三 结果与分析
• 3.1 脂肪体总RNA的抽提
• 3.2 RT-PCR及3'RACE扩增的结果
• 3.3 柳蚕卵黄原蛋白cDNA序列分析
• 3.4 cDNA序列同源性比较
• 3.5 柳蚕卵黄原蛋白的亚基和酶切位点
• 3.6 信号肽的氨基酸残基
• 3.7 多聚丝氨酸区
• 3.8 与天冬氨酸连接的糖基化位点
• 3.9 特殊功能位点
• 3.10 系统发生树的建立
• 四 讨论
• 五 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介