鲢低氧应激相关基因的克隆与表达分析

论文摘要

工农业的快速发展已经导致淡水养殖用水水质的严重恶化,水体中氧的承载力也极度下降,造成水生生物频繁产生缺氧应激反应,影响水产养殖产量。鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是我国淡水养殖的主要种类,在我国淡水水域广泛分布。鲢性燥,在各种应激刺激后即跳跃出水,耐低氧能力差,易发生大面积翻塘,在长期的养殖实践中造成了巨大的损失。因此探讨鲢低氧胁迫下的应激机制对于理解其生理特性以及抗低氧应激新品种选育很有意义。本研究,以遗传背景非常一致的雌核发育鲢后代为实验材料,通过同源克隆,获得三个已知在低氧胁迫应激中扮演重要角色的功能基因（HIF-1α,SODs,Tf）的cDNA全长序列,通过序列分析,预测其蛋白结构及功能。采用SYBR-green I荧光定量PCR技术研究了上述功能基因在组织表达差异,胚胎发育表达等以及在急性低氧胁迫处理后0h,3h,6h,9h,12h,15h,18h等的mRNA表达水平在肝脏和鳃中的变化。结果表明：（1）克隆得到鲢HIF-1α基因的cDNA全序列,长3828 bp,最大开放阅读框长2325 bp,编码774个氨基酸。鲢HIF-1α与草鱼具有最高的氨基酸序列一致性达到95%,其次为团头鲂（95%）,鲤鱼（90%）,麦穗鱼（90%）,斑马鱼（88%）,可见HIF-1a在鲤科鱼类中高度保守,鲢HIF-1α同非鲤科鱼类的氨基酸序列一致性也达到了60%-75%,而同哺乳动物的氨基酸一致性也有57%。保守结构域分析表明,鲢氨基酸序列,具有bHLH结构域,两个PAS结构域,C-TAD保守结构域以及一段可以被pVHL泛素化识别的靶序列,具备HIF-1α基因的主要功能结构域。鲢HIF-1α在各个组织均有分布,但具有组织特异性,在心脏,脑,肌肉,鳃中的表达量较高,而在肝脏,肾脏,脾脏的表达量均较低。鲢HIF-1α的表达贯穿胚胎发育的整个过程,是一种高度动态的表达模式,于细胞分裂期（2-4细胞）表达量最高（p<0.05）,之后明显降低（p<0.05）。在肝脏中,HIF-1α在低氧胁迫9小时后表达量明显增高,并保持增加的趋势直至最后（增加50倍）。而在鳃中,HIF-1α低氧胁迫3小时后,表达量开始增加,到12小时达到最大值（15倍）,之后,逐渐减少,到最后降低到正常对照组的表达水平。结果表明,鲢HIF-1α基因具备低氧诱导因子家族的主要特征,在鲢的低氧适应反应中通过转录水平上的变化,从而通过诱导参与各生命过程的靶基因的表达变化来完成机体对低氧胁迫应激的适应,而其调控表达模式也具备组织特异性。（2）克隆得到鲢Cu/Zn-SOD cDNA全长753 bp,编码154个氨基酸；Mn-SOD cDNA序列全长1008 bp,编码224个氨基酸。两个基因序列上均有Kozak序列及加尾信号多聚腺苷酸,证明了克隆序列的完整性。通过氨基酸序列分析,鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD具备各自的特征片段,以及保守的金属辅因子结合位点。鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在心脏、脑、肝脏、肾脏、脾脏、鳃、肌肉、血液八种组织中均表达,其中Cu/Zn-SOD在肝脏和脾脏中大量表达,而Mn-SOD则在鳃中有最高的表达量。在胚胎发育过程中,两个基因均在桑葚期达到最高水平,于囊胚期表达量开始下降。在肝脏,Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在急性低氧胁迫开始的3个小时内的mRNA表达水平增高,之后开始降低,并一直保持较低的表达水平直到最后。在鳃中,Cu/Zn-SOD的表达水平在低氧胁迫开始后就持续增加直到实验结束,而Mn-SOD的表达则相对比较动态化,没有明显的增加或减少的趋势。结果表明SODs的组织特异性表达变化对于鲢低氧应激的适应起到至关重要的作用。（3）克隆得到鲢Tf cDNA全长2365 bp,最大开放阅读框2025 bp,编码674个氨基酸。蛋白结构预测分析,在N端21个氨基酸为信号肽,长14个氨基酸,第24至327个氨基酸以及第335至665个氨基酸为两个保守的结构域。鲢转铁蛋白与草鱼转铁蛋白的同源性高达74%,与人转铁蛋白同源性最低,为39%,其他鲤科鱼类转铁蛋白的同源性约65%—73%,与非鲤科鱼类的同源性约43%—50%。系统进化树分析显示,鲢转铁蛋白基因与斑马鱼、鲤鱼、鲫鱼、草鱼等几种鲤科鱼类亲缘关系最近,单独聚为一支。鲢转铁蛋白基因仅在肝脏和脾脏中表达,肝脏中表达量最高,脾脏次之,在心脏、脑、肾脏、肌肉、鳃、血液中均不表达。在胚胎发育过程中,转铁蛋白基因对原肠中期后的器官分化和形态建成起到了一定的作用,而未影响原肠中期前的细胞分裂增殖。本研究第一次克隆得到鲢三个功能基因HIF-1α,SODs,Tf的cDNA全长序列,并分析了各自的表达特征及其在低氧胁迫应激过程中的表达变化,首次从转录水平上揭示了其在鲢抗胁迫应激反应中的重要作用,为进一步研究鱼类低氧胁迫反应的机理奠定了一定的基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1.1 鲢的生物学特性及生产中的问题
• 1.2 低氧胁迫对鱼类的生理生化影响
• 1.3 低氧适应相关基因的研究
• 1.4 鱼类抗氧化系统的研究
• 1.5 技术路线
• 1.6 实验器材及试剂
• 1.6.1 实验仪器
• 1.6.2 主要试剂
• 1.6.3 常用的主要试剂配方
• 1.7 本研究的目的及意义
• 第二章 鲢低氧诱导因子HIF-1α的克隆和序列分析及低氧胁迫下的表达分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 总RNA的抽提和cDNA第一链的合成
• 2.1.3 引物设计
• 2.1.4 鲢HIF-1α保守区RT-PCR反应
• 2.1.5 鲢HIF-1α末端序列克隆
• 2.1.6 PCR产物回收
• 2.1.7 测序
• 2.1.8 序列特征分析及系统发育分析
• 2.1.9 鲢HIF-1α的组织表达及胚胎发育表达分析
• 2.1.10 急性低氧胁迫下鲢HIF-1α的mRNA表达变化分析
• 2.1.11 数据处理方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 RT-PCR扩增鲢HIF-1α基因cDNA核心片段
• 2.2.2 SMART RACE法扩增鲢HIF-1α基因5’及3’末端
• 2.2.3 鲢HIF-1α基因的生物信息学分析
• 2.2.4 鲢HIF-1α的组织分布
• 2.2.5 鲢HIF-1α胚胎发育过程中的表达变化
• 2.2.6 急性低氧胁迫下,鲢肝脏、鳃中HIF-1α的表达变化
• 2.3 讨论
• 第三章 鲢Cu/Zn-SOD、Mn-SOD的克隆和序列分析及急性低氧胁迫下的表达变化
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因的克隆和序列特征分析
• 3.2.2 鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD氨基酸比对及系统进化分析
• 3.2.3 鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的组织表达
• 3.2.4 鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD胚胎发育过程中的表达变化
• 3.2.5 急性低氧胁迫下鲢Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达变化
• 3.3 讨论
• 第四章 鲢转铁蛋白基因cDNA的克隆及在胚胎期的表达分析
• 4.1 材料和方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 鲢Tf cDNA的克隆及序列分析
• 4.2.2 鲢Tf系统比对
• 4.2.3 鲢Tf在不同组织的表达分析
• 4.2.4 鲢Tf在胚胎发育过程中的时序表达模式及表达水平
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录