农抗702生料发酵工艺及溶媒萃取工艺研究

论文摘要

链霉菌702是江西农业大学应用微生物研究室从土壤中分离筛选获得,其产生的抑真菌活性物质对植物病原真菌有很强的抑制作用,有望开发成为新型高效生物杀菌剂。为了进一步对其生料发酵工艺优化提高其发酵产量,本文以链霉菌702-M-N-52菌株为试验菌株,利用现代发酵优化策略对其生料发酵工艺进行了优化,其方法及结果如下：1、为了探索农抗702产生菌链霉菌702种子最佳工艺条件,提高种子质量。通过单因素试验、正交试验及二次旋转正交试验设计和拟水平法正交试验分别对链霉菌702固体斜面产孢子培养工艺和液体种子培养工艺进行了研究。得到链霉菌702固体斜面产孢子最佳培养基为蔗糖浓度为3%的PDA培养基。蛋白胨和氯化钠对其均有抑制作用。最佳培养条件组合为：培养温度29℃、初始pH值8、培养时间5天。在最佳培养基和培养条件下,每支试管斜面产孢子量达到4.37亿,是高氏一号培养基斜面孢子数0.93亿的4.90倍；液体种子培养较佳配方：即蔗糖6.67g/L,玉米粉为33.33 g/L,蛋白胨为1.33 g/L,黄豆饼粉为20 g/L,碳酸钙0.6%、豆油0.4%。液体种子培养的较佳条件,即初始pH7,装液量40mL,接种量2.5%,温度30℃。200r/min回转式摇床旋转培养48h。在优化后的培养条件下,链霉菌702种子液生物量及发酵液效价分别提高70.2%和11.7%。2、在摇瓶条件下通过单因素试验、二次旋转正交试验、四因素三水平正交试验设计、基于分批发酵代谢参数分析进行的分批补料试验对链霉菌702摇瓶生料发酵工艺条件进行研究。得到较高产量农抗702的培养基配方（g/L）：玉米淀粉25.0,玉米粉35.0,葡萄糖10.0,黄豆饼粉12.0,蛋白胨8.0；硝酸钾1.0,氯化钙5g,磷酸二氢钾0.3g,豆油10mL和生料发酵培养条件：装液量50mL,接种量10%,生料发酵添加剂为0.5%,初始pH7,30℃,200r/min回转式摇床旋转培养104h。在筛选到的最佳发酵培养基配方和发酵条件下摇瓶发酵农抗702效价达到7432.6μg/mL,比优化前提高了9.07%。在摇瓶发酵48h补加葡萄糖和蛋白胨溶液,使发酵液中的葡萄糖和蛋白胨浓度分别达到10.0g/L和3g/L发酵液,发酵至114h发酵液中农抗702效价达到11346.6μg/mL,比不补料发酵的效价7424.6μg/mL提高52.8%分别达3.016g/L、5682.7μg/mL。3、通过在500L罐上进行免蒸高压蒸汽灭菌分批不补料和分批补料的生料发酵试验。并定时检测两种发酵方式中发酵液农抗702效价、总糖、还原糖、氨基氮和溶磷等各代谢参数,分别绘制分批发酵和补料发酵的代谢曲线,利用Origin 7.5软件对分批发酵实验数据进行非线性拟合等分析。分别获得：菌体生长与发酵时问的关系产物形成和发酵时间的关系和基质消耗和时间之间的关系三个动力学模型；农抗702在500L灌中的发酵效价.分批不补料与分批补料发酵情况下最高分别达到8412.1μg/mL和12164.81μg/mL,补料分批生料发酵的生产率（P）比不补料分批发酵提高了74%。4、采用单因素试验分别对农抗702最佳浸提溶剂、浸提条件进行研究。得到无水甲醇为最佳浸提溶剂,最佳浸提比例为发酵液与无水甲醇为1：2（v/v）,浸提3次能完成100%浸提率,发酵液PH不需要调整,浸提温度和浸提时间的影响不大。初步探索从发酵液中分离提取农抗702工艺,为农抗702杀菌剂的制备奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 农抗702概述
• 1.1.1 农抗702的产生菌及其理化性质
• 1.1.2 农抗702对植物病原真菌的作用机制研究
• 1.1.3 链霉菌702菌种诱变
• 1.1.4 农抗702应用试验研究
• 1.1.5 链霉菌702发酵工艺研究
• 1.2 工业微生物发酵工艺的研究
• 1.2.1 发酵培养基的组成与优化
• 1.2.2 分批补料发酵的调控策略
• 1.3 生料发酵
• 1.3.1 生料发酵在酿酒中的应用
• 1.3.2 生料发酵在酿醋中的应用
• 1.3.3 生料发酵在单细胞蛋白饲料中的应用
• 1.4 本论文课题来源、研究背景、意义和内容
• 1.4.1 本论文课题来源
• 1.4.2 本论文研究背景和意义
• 1.4.3 本论文主要研究内容
• 1.4.4 本论文主要研究的技术路线
• 第二章 链霉菌702种子培养工艺研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 药品试剂
• 1.1.4 仪器设备
• 1.1.5 统计分析软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 孢子培养
• 1.2.2 链霉菌720袍子数与其透光率标准曲线绘制
• 1.2.3 固体斜面培养基上链霉菌702孢子含量测定
• 1.2.4 链霉菌702产孢子固体斜面培养基的优化
• 1.2.5 链霉菌702产孢子斜面培养条件的优化
• 1.2.6 链霉菌702液体种子培养基的优化
• 1.2.7 链霉菌702液体种子培养条件的优化
• 1.2.8 链霉菌702发酵液生物效价测定
• 2.结果与分析
• 2.1 链霉菌702产孢子固体斜面培养基的优化
• 2.1.1 链霉菌702孢子培养基的初筛
• 2.1.2 斜面培养基不同蔗糖浓度对孢子数产量的影响
• 2.1.3 不同蛋白胨浓度对链霉菌702产孢子数的影响
• 2.1.4 不同氯化钠浓度对链霉菌702产孢子数的影响
• 2.2 链霉菌702产孢子固体斜面最佳培养条件的优化
• 9（3⁴）正交试验结果'>2.2.1 三因素三水平的L₉（3⁴）正交试验结果
• 2.2.2 优化前后对比试验结果
• 2.3 液体种子培养基的优化
• 2.3.1 二次正交旋转组合设计确定液体种子培养基最佳组合
• 2.4 链霉菌702液体种子培养条件优化
• 2.4.1 四因素不同水平数混合正交试验结果
• 2.4.2 优化前后对比试验结果
• 2.5 链霉菌702种子培养种子生长曲线
• 2.6 最佳接种种龄的确定
• 3 结论与讨论
• 第三章 农抗702摇瓶生料发酵工艺研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 药品及主要试剂
• 1.1.5 试验仪器
• 1.1.6 统计软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 孢子培养
• 1.2.2 摇瓶培养方法
• 1.2.3 分析方法
• 1.2.4 摇瓶分批生料发酵研究
• 1.2.5 摇瓶分批补料发酵研究
• 2 结果与分析
• 2.1 生料发酵添加剂添加量的确定
• 2.2 生料发酵培养基优化结果
• 2.2.1 二次旋转正交试验结果
• 2.2.2 二次旋转正交试验方差分析结果
• 2.3 生料发酵培养条件优化结果
• 2.4 链霉菌702摇瓶分批生料发酵发酵周期及代谢数据测定
• 2.5 补加不同碳源对农抗702合成的影响
• 2.6 补加葡萄糖浓度及时间对农抗702合成的影响
• 2.7 补加氮源对农抗702合成的影响
• 2.8 葡萄糖与蛋白胨补加方式对农抗702合成的影响
• 3 结论与讨论
• 第四章 链霉菌072 500L罐生料发酵工艺研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 药品
• 1.1.4 仪器设备
• 1.1.5 统计、画图软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 孢子培养
• 1.2.2 一级种子摇瓶培养
• 1.2.3 二级种子培养
• 1.2.4 生料发酵
• 1.2.5 补料生料发酵
• 1.2.6 分析方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 链霉菌702 500L罐生料分批发酵代谢数据测定
• 2.2 链霉菌702 500L罐生料分批发酵典型代谢曲线
• 2.3 链霉菌702 500L罐生料分批发酵动力学模型的建立
• 2.3.1 菌体生长与发酵时间的关系
• 2.3.2 产物形成和发酵时间的关系
• 2.3.3 基质消耗和时间之间的关系
• 2.3.4 模型拟合求解与检验
• 2.4 链霉菌702 500L罐补料生料发酵代谢数据测定
• 2.5 链霉菌702 500L罐生料补料发酵典型代谢曲线
• 2.6 补料与不补料发酵过程中产素、菌体生物量转化率及生产率等参数比较
• 2.6.1 500L罐生料发酵葡萄糖-抑真菌物质转化率计算
• 2.6.2 500L罐分批发酵葡萄糖-菌体干重转化率计算
• 2.6.3 500L发酵罐分批发酵及补料发酵生产率计算
• 3 结论与讨论
• 第五章 农抗702溶媒萃取工艺研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 链霉菌702发酵液
• 1.1.2 抑菌测定指示菌
• 1.1.3 抗生素标品
• 1.1.4 层平板培养基
• 1.1.5 仪器设备和试剂原料
• 1.2 方法
• 1.2.1 溶媒的筛选
• 1.2.2 发酵液与无水甲醇浸提比例的筛选
• 1.2.3 发酵液不同pH值对无水甲醇浸提效果的影响
• 1.2.4 温度对无水甲醇浸提效果的影响
• 1.2.5 浸提时间对甲醇浸提效果的影响
• 1.2.6 发酵液浸提次数的选择
• 1.2.7 发酵液上清液和菌丝体中农抗702的含量比例测定
• 1.2.8 农抗702的效价检测
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同溶剂对对发酵液的提取效果
• 2.2 发酵液与无水甲醇浸提比例的筛选
• 2.3 发酵液不同pH值对无水甲醇浸提效果的影响
• 2.4 温度对无水甲醇浸提效果的影响
• 2.5 浸提时间对甲醇浸提效果的影响
• 2.6 发酵液浸提次数的选择
• 2.7 发酵液上清液和菌丝体中农抗702的含量比例测定
• 3.结论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 论文创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在校期间论文投稿发表情况表