结核分枝杆菌whiB3转录因子的功能及调控机制研究

论文摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）在感染过程中为了应对宿主细胞内的各种环境压力,必须及时响应环境信号,调控基因的表达。已有研究证明whiB3在分枝杆菌的生长和环境适应中发挥重要调控作用,但具体机制尚不清楚。本课题对WhiB3的转录调控功能及作用机制进行了探讨,主要取得了以下几方面的结果：（1）通过随机突变,构建了whiB3基因的随机突变文库,并进行单/双杂交筛选、EMSA实验以及互补实验等一系列研究,初步发现WhiB3的重要功能位点位于其α螺旋区域及其C末端的AT-hook结构域；（2）证实了耻垢分枝杆菌中的WhiB也具有DNA结合功能；（3）构建获得了US△whiB的各种互补菌株,并在1.5 mMH2O2胁迫条件下测定了它们的生长曲线,发现C末端缺失的突变基因耻垢分枝杆菌MSwhiB△C几乎不能使敲除突变株回复其野生菌株的抗性表型,而在结核分枝杆菌中MtbwhiB3full，MSwhiBfull, MtbwhiB3△C表现出较为明显的互补效应；（4）用WhiB3作为诱饵筛选Mtb的全基因组ORF文库,获得了与WhiB3相互作用的蛋白质,并通过Pull-down和SPR实验对筛选结果进行了抽样验证；（5）发现了结核分枝杆菌WhiB3与其RNA聚合酶α亚基存在相互作用,这种相互作用可能促进WhiB3与靶DNA的结合。whiB家族基因在分枝杆菌中广泛保守,本研究证明了WhiB3蛋白的DNA结合功能,鉴定了其重要的功能位点,并发现了WhiB3能与众多蛋白相互作用；特别是本研究发现了致病性的结核分枝杆菌和非致病性的耻垢分枝杆菌WhiB3基因在功能上存在差异,这些工作为进一步理解分枝杆菌的抗性机制和致病机理提供了线索。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 结核分枝杆菌重要转录调控因子
• 1.1.1 sigma因子
• 1.1.2 双组份系统
• 1.1.3 蛋白激酶
• 1.1.4 其他转录因子
• 1.2 whiB基因家族
• 1.2.1 whiB基因家族的研究进展
• 1.2.2 Mtb whiB家族成员whiB3的研究近况
• 1.2.3 whiB基因家族其他成员研究
• 1.3 结核分枝杆菌脂代谢相关重要基因
• 1.4 AT-hook蛋白相关研究进展
• 1.5 本课题提出的背景及意义
• 1.6 本课题的内容及研究目标
• 1.6.1 主要研究内容
• 1.6.2 研究目标
• 2 实验材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 抗生素及培养基
• 2.1.3 实验所用质粒
• 2.1.4 酶,试剂和试剂盒
• 2.1.5 PCR反应引物,合成的片段及大小
• 2.1.6 缓冲液及试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学基本操作
• 2.2.2 细菌双杂交实验
• 2.2.3 单杂交筛选实验
• 2.2.4 His标签蛋白和GST标签蛋白的亲和纯化
• 2.2.4.1 表达载体的构建
• 2.2.4.2 IPTG诱导蛋白质表达
• 2.2.4.3 含有6×his融合标签蛋白的亲和纯化
• 2.2.4.4 含有GST融合标签蛋白的亲和纯化
• 2.2.4.5 蛋白的透析
• 2.2.5 大分子相互作用检测
• 2.2.5.1 蛋白Pull-Down
• 2.2.5.2 Western blotting检测
• 2.2.6 凝胶阻滞迁移分析（EMSA）
• 2.2.6.1 琼脂糖凝胶EMSA
• 2.2.6.2 同位素凝胶EMSA
• 2.2.7 SPR实验
• 2.2.8 随机突变
• 2.2.9 功能互补实验
• 2.2.9.1 互补菌株及对照菌株的构建
• 2.2.9.2 胁迫条件下生长曲线的测定
• 2.2.10 染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecitation,Ch-IP）
• 3 结果与分析
• 3.1 WhiB3重要活性位点位于α螺旋区域和AT-hook中
• 3.1.1 构建whiB3的随机突变体库
• 3.1.2 单杂交筛选寻找whiB3的重要位点
• 3.1.3 WhiB3 97位甘氨酸突变后DNA结合活性消失
• 3.1.4 Mtb whiB3与MS whiB功能相关
• 3.1.4.1 MS-WhiB具有与Mtb-WhiB3类似的DNA结合活性
• 3.1.4.2 双杂交验证MtbwhiB3/MSwhiB和Rv3457c/MS1524相互作用
• 3.1.5 互补实验验证筛选位点的重要性
• 3.1.5.1 互补菌株的构建
• 3.1.5.2 功能互补实验
• 3.2 WhiB3与众多功能基因存在相互作用
• 3.2.1 双杂交筛选寻找与WhiB3互作的基因
• 3.2.2 体外实验证明筛选得到的蛋白互作可靠
• 3.2.2.1 互作基因与WhiB3的体内共表达
• 3.2.2.2 Western Blotting检验体内Pull-down
• 3.2.3 SPR（表面等离子共振）验证相互作用
• 3.2.4 WhiB3与Mtb RNA聚合酶α亚基存在相互作用 #53
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 Mtb WhiB家族的DNA结合功能
• 4.2.2 Mtb WhiB3的重要活性位点
• 4.2.3 WhiB3与其他蛋白的相互作用
• 4.2.4 WhiB3与抗氧化胁迫
• 4.2.5 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录