水产品中硝基呋喃代谢物残留的ELISA快速检测方法研究

论文摘要

硝基呋喃类药物属于一类人工合成的抗生素,因为价廉易得,被广泛应用于水产养殖中的病害防治。硝基呋喃类药物在动物体内代谢迅速,但是其代谢物可在机体内稳定存在。水产品中的硝基呋喃代谢物残留严重威胁消费者的健康,因此,世界各国均把硝基呋喃类药物列入禁用渔药。目前,硝基呋喃代谢物LC-MS/MS方法已经建立,但是该方法需要昂贵的仪器和复杂的前处理,分析时间长、成本高,不便于现场分析。而ELISA检测方法具有快速简便、易于操作等优点,适合大样本筛查。本研究旨在探索同时检测多种硝基呋喃代谢物的分析方法,初步建立水产品中硝基呋喃代谢物残留的ic-ELISA检测方法。首先采用甲醇钠催化β-羟乙基肼和DMC缩合生成呋喃唑酮代谢物AOZ,然后对三种硝基呋喃代谢物AOZ、SEM、AHD进行羧基化衍生,并利用活性酯法依次将三种小分子抗原同HSA进行偶联,获得免疫原。而包被原的合成则采用混合酸酐法,将4-CPAOZ、4-CPSEM、4-CPAHD分别同OVA偶联。通过薄层色谱、紫外扫描、LC-MS/MS来鉴定半抗原、免疫原和包被原的合成,并通过紫外光谱扫描法计算了半抗原-载体蛋白的偶联比,测得4-CPAOZ、4-CPSEM、4-CPAHD与载体的偶联比为4:1,11:1,14:1。采用合成的免疫原（4-CPAOZ）4-（4-CPSEM）11-（4-CPAHD）14–HSA免疫新西兰大白兔,获得同时对4-CPAOZ、4-CPSEM、4-CPAHD具有选择性的抗血清,经过辛酸-硫酸铵盐析法纯化和透析脱盐处理后,获得了纯化的抗体,并利用棋盘法和ic-ELISA方法测定抗体的效价分别为1:16000、1:12000、1:16000。利用获得的多抗建立了ic-ELISA检测硝基呋喃代谢物的方法,通过棋盘法和顺序参数分析,对ELISA检测过程的几个重要参数进行优化,找出ELISA实验的最佳反应条件。NPAOZ的ic-ELISA标准曲线的线性回归方程为y=-42.5595 x+66.4298,R2=0.9866,线性范围为0.510 ng/mL。NPSEM的ic-ELISA标准曲线的线性回归方程为y=-65.0732 x+100.9356,R2=0.9842,线性范围为225 ng/mL。NPAHD的ic-ELISA标准曲线的线性回归方程为y=-61.5168 x+95.4171,R2=0.9879,线性范围为225 ng/mL。空白桂花鱼样品的加标回收实验表明,回收率介于80%120%之间,且变异系数均小于15%,表明该方法适合进行水产品中硝基呋喃代谢物的检测分析,为进一步的商用试剂盒开发建立了良好的研究基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 硝基呋喃类药物概述
• 1.1.1 硝基呋喃类药物的主要物理化性质
• 1.1.2 硝基呋喃类药物的主要药理作用和使用情况
• 1.1.3 硝基呋喃类药物的主要代谢特点和途径
• 1.1.4 硝基呋喃类药物的危害及现状
• 1.2 硝基呋喃类药物检测技术
• 1.2.1 硝基呋喃类药物的国家标准检测方法
• 1.2.2 硝基呋喃类药物的仪器检测方法
• 1.2.3 硝基呋喃类药物的免疫学检测方法
• 1.3 本论文的研究目的与意义
• 第2章 硝基呋喃代谢物抗原的合成、衍生化及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药品试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 呋喃唑酮（FZD）代谢物 3-氨基2噁唑烷酮（AOZ）的化学合成
• 2.2.2 3-氨基2噁唑烷酮的衍生化
• 2.2.3 呋喃西林（NFZ）代谢物氨基脲（SEM）的衍生化
• 2.2.4 呋喃妥因（NFT）代谢物 1-氨基乙内酰脲（AHD）的衍生化
• 2.2.5 LC-MS/MS分析
• 2.2.6 免疫原和包被原的制备
• 2.2.7 完全抗原偶联比的测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 AOZ的鉴定
• 2.3.2 4-CPAOZ的鉴定
• 2.3.3 4-CPSEM的鉴定
• 2.3.4 4-CPAHD的鉴定
• 2.3.5 免疫原、包被原的鉴定
• 2.3.6 免疫原偶联比的测定
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 硝基呋喃代谢物抗体的制备、纯化及分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 药品试剂
• 3.1.2 仪器设备
• 3.1.3 主要溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗血清的制备
• 3.2.2 抗血清的分离与保存
• 3.2.3 抗血清的纯化
• 3.2.4 纯化抗血清的SDS-PAGE分析
• 3.2.5 抗血清效价的测定
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 抗血清纯化效果分析
• 3.3.2 抗体的效价
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 硝基呋喃代谢物ELISA检测方法的建立和优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 药品试剂
• 4.1.2 仪器设备
• 4.1.3 主要溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 硝基呋喃代谢物间接竞争ELISA检测方法的建立
• 4.2.2 硝基呋喃代谢物ic-ELISA方法的条件优化
• 4.2.3 样品前处理方法
• 4.2.4 硝基呋喃代谢物ic-ELISA方法的评估
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 硝基呋喃代谢物ic-ELISA参数的确定
• 4.3.2 硝基呋喃代谢物ic-ELISA方法的评估
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 总结与展望
• 5.1 研究总结
• 5.2 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文