论文摘要
第一部分体内逆转录病毒介导的sFlt-1抑制小鼠骨肉瘤生长的实验研究研究背景骨肉瘤是一种常见的高度恶性骨肿瘤。近年来应用的多种治疗方法,包括广泛的手术切除、截除患肢和辅助性的化疗已经改善了患者的预后;但是仍有接近半数的患者疗效不理想。骨肉瘤病人的治疗仍旧是一项艰巨的任务。近来针对恶性肿瘤的一种新的治疗策略是阻断其血管发生。事实上,肿瘤的生长、浸润和转移依赖新生血管的形成;这一过程是通过血管发生的机制来调节,血管生成的促进因素以及抑制因素决定了肿瘤血管的发展方向。目前已经有很多促血管生长因子被证实,其中血管内皮生长因子（VEGF）的特异性和作用最强。研究证实,包括骨肉瘤在内的很多恶性肿瘤的生长发育和预后不良同VEGF的高表达相关联;这些结果提示,抑制VEGF的生物学效应也许是骨肉瘤治疗中很有希望的一种方法。VEGF通过结合内皮细胞的表面受体来发挥其生物效应,这些表面受体主要包括VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（Flk-1）等,它们是左右细胞增殖、分化、迁移和新陈代谢等信号传导通路的必需因素。可溶性Flt-1（sFlt-1）是Flt-1的可替代形式,同VEGF有着与Flt-1相当的亲和力和特异性,但是缺乏细胞内酪氨酸激酶区域,所以无法传递信号。已经有一些研究应用sFlt-1基因转导技术阻断VEGF生物学效应以达到抑制不同实体瘤生长和转移的目的,总体结果分析表明,这个方法是一种非常有潜力的血管生成抑制策略。而应用sFlt-1基因转导技术阻断VEGF生物学效应的方法治疗骨肉瘤尚未见有报道。目的调查逆转录病毒介导的sFlt-1基因针对高VEGF表达的人骨肉瘤G-292细胞进行体外转导的效率,并构建重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠的骨肉瘤模型评估sFlt-1转基因治疗对于骨肉瘤生长的抑制作用。材料与方法1.动物30只雌性四周龄的SCID小鼠作为骨肉瘤模型的宿主。这些SCID小鼠的生长环境是无菌的,被提供经过高压消毒的食物和饮水;实验开始之前隔离至少一周时间。2.骨肉瘤细胞株高VEGF表达的人骨肉瘤G-292细胞株进行细胞培养,长至90%融合状态时测定细胞活力以及细胞数目,按照1:6-1:8比例传代继续培养。3.基因转导逆转录病毒编码sFlt-1和逆转录病毒编码LacZ针对G-292细胞进行体外基因转导。500μl的106cfu retrosFlt-1（或MFG-LacZ）、500μl新鲜培养液和终浓度为8μg/ml的聚凝胺一同加入G-292细胞;37℃孵育8个小时后第二次加入同样剂量的上述转导液继续培养。细胞培养液中sFlt-1基因转导产物的含量通过ELISA实验测定;X-gal染色测定转导细胞中LacZ基因的表达及转导效率。4.骨肉瘤模型建立SCID小鼠被随机分为3组,每组10只,分别应用G-292细胞、sFlt-1转导G-292细胞、LacZ转导G-292细胞接种到小鼠一侧肢体的胫骨近端建立骨肉瘤模型。另外一侧肢体单纯注射不包含细胞的培养液作为假手术组。肿瘤细胞接种8周后收集胫骨骨肉瘤以及骨组织标本。5.MicroCT测评应用MicroCT动态监测肿瘤的生长。接种细胞后当天以及第2,4,6,8周各扫描一次。采集MicroCT图像后对肿瘤的长和宽进行测量并应用公式计算肿瘤体积。6.分子生物学检测骨肉瘤和骨组织标本抽提总RNA,应用RNeasy Mini Kit试剂盒作进一步的纯化处理。实时定量PCR方法测定VEGF和sFlt-1基因的相对定量表达。7.组织学和免疫组织学检查实验动物接受细胞接种8周后收集胫骨近端的骨肉瘤组织和假手术组的骨组织。应用10%福尔马林缓冲液固定,12%EDTA脱钙,石蜡包埋。苏木精-伊红（HE）染色后在光学显微镜下观察。应用免疫组织化学的抗生物素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）检测VEGF,sFlt-1和CD34的表达。数字影像收集后应用Image-Pro软件包对比分析不同组间VEGF和sFlt-1积分光密度（IOD）的差异。CD34染色结果用来测定骨肉瘤微血管密度（MVD）。8.统计学分析SPSS软件包对各组实验数据进行t检验或方差分析并进行多重比较。p＜0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。结果1.细胞培养结果细胞主要呈梭形和多边形,大小不等。sFlt-1转导的G-292细胞和LacZ转导的G-292细胞形态和增殖能力同G-292组一致,未观察到急性细胞毒性的现象发生。2.转基因表达ELISA实验测定细胞培养液中sFlt-1基因转导产物的含量。病毒转导后24h检测到了sFlt-1高水平的表达,14天时达到了峰值,转基因产物高水平的表达至少维持了6周的时间。免疫组织化学染色结果显示,sFlt-1转导组sFlt-1基因强阳性表达;积分光密度（IOD）结果证实,相比较G-292组和LacZ转导组,sFlt-1转导组sFlt-1有着更高的表达,差异有显著性（p＜0.05）。采用X-gal染色的LacZ转导G-292细胞显示强力的蓝染,证明转染成功并且平均转导效率为78.6±6.8%。3.sFlt-1对骨肉瘤生长的抑制效应2周一次的MicroCT扫描动态监测发现SCID小鼠胫骨近端原发性骨肉瘤在不断生长;应用MicroView程序分析数据证实,细胞种植后2周时所有小鼠胫骨近端都出现了骨肉瘤的发生发育,sFlt-1转导组骨肉瘤体积小于G-292组和LacZ转导组,无显著性差异;在细胞种植后4,6,8周时,sFlt-1转导组骨肉瘤体积明显小于G-292组和LacZ转导组,有显著性差异（p＜0.05）。4.组织学和免疫组织化学评估组织学表现显示了典型的骨肉瘤特征,包括重度的细胞多型现象、骨质破坏和新生血管形成。免疫组织化学染色结果显示,G-292组和LacZ转导组肿瘤切片的VEGF强阳性表达,比较积分光密度（IOD）数值发现,sFlt-1组VEGF的表达低于其他两组,无显著性差异。sFlt-1转导组肿瘤切片的sFlt-1抗体强阳性表达,sFlt-1积分光密度数值高于其他两组,有显著性差异（p＜0.05）。5.骨肉瘤微血管密度（MVD）计数结果sFlt-1转导组微血管密度明显小于G-292组和LacZ转导组,具有显著性差异（p＜0.05）。6.实时定量PCR测定结果相对于假手术组正常骨组织,G-292组和LacZ转导组骨肉瘤标本的VEGF表达分别高达14.15±2.88倍和13.62±3.83倍;sFlt-1转导组的VEGF表达低于其他两组,无显著性差异。sFlt-1转导组的sFlt-1基因相对定量表达为4.55±1.27倍,高于其他两组,有显著性差异（p＜0.05）。结论1,体外使用逆转录病毒编码sFlt-1成功转导了高VEGF表达的人骨肉瘤G-292细胞,建立了能够稳定表达sFlt-1基因的骨肉瘤细胞株。2,MicroCT动态监测、实时定量PCR测定和免疫组织化学检查结果证实VEGF高表达与骨肉瘤的发生发展密切相关。3,MicroCT扫描动态监测发现,在肿瘤细胞种植后4,6,8周时,sFlt-1转导组骨肉瘤的体积明显小于G-292组和LacZ转导组,表明sFlt-1转导组骨肉瘤生长被持续抑制,证明sFlt-1在骨肉瘤生长发育过程中是一种长久有效的干预因素。4,免疫组织化学CD34染色结果显示,sFlt-1转导组骨肉瘤微血管密度明显小于其他两组;证实sFlt-1通过阻滞VEGF的生物学效应导致了骨肉瘤生长发育的抑制。第二部分c-myc和c-fos原癌基因在小鼠骨肉瘤模型中的表达及意义研究背景伴随着分子生物学技术的进步,与恶性肿瘤发育和远处转移密切相关的基因成为研究热点。研究发现细胞内癌基因通过DNA重排（前病毒插入、染色体易位和DNA扩增）而被激活。这些基因序列的修改可能导致基因的表达增强或失去控制。在骨肉瘤中,已经有很多种致癌基因和抑癌基因被发现和证实,其中以c-myc和c-fos最为活跃。c-myc原癌基因是第8对染色体编码的转录因子,它涉及到细胞生长的调节、DNA复制和特异靶基因转录子的调控。c-fos原癌基因是v-fos的细胞同系物,它调控着成骨细胞和软骨细胞的分化。目的调查c-myc和c-fos两种原癌基因在重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠骨肉瘤模型中的表达,进一步探讨VEGF,sFlt-1以及骨肉瘤的生长和抑制同它们的关联。材料和方法1.实时定量PCR测定c-myc和c-fos基因的实时定量表达应用荧光定量PCR分析仪测定,并计算实验组相对于假手术组的基因相对定量表达。2.免疫组织化学检测实验动物接受细胞接种8周后收集胫骨近端的骨肉瘤组织和假手术组的骨组织。应用10%福尔马林缓冲液固定,12%EDTA脱钙,石蜡包埋。应用免疫组织化学的抗生物素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）检测c-myc和c-fos基因的表达。数字影像收集后应用Image-Pro软件包对比分析不同组间积分光密度（IOD）的差异。3.统计学分析SPSS软件包对各组实验数据进行t检验或方差分析并进行多重比较。p＜0.05表示具有显著性差异。所有数值用平均值±标准差表示。结果1.基因相对定量表达结果在原发性肿瘤样本中,G-292组和LacZ转导组c-myc高表达,分别为正常骨组织的8.06±1.26倍和7.60±1.14倍,sFlt-1转导组的c-myc基因表达低于G-292组和LacZ转导组,有显著性差异（p＜0.05）;G-292组和LacZ转导组c-fos高表达,分别为正常骨组织的4.73±0.96倍和4.83±1.03倍,sFlt-1转导组的c-fos基因表达低于G-292组和LacZ转导组,无显著性差异。2.免疫组织化学方法评估免疫组织化学染色结果显示,全部三组肿瘤切片均有c-myc和c-fos抗体阳性表达。积分光密度（IOD）数值统计分析表明,三组肿瘤切片的c-fos抗体表达无显著性差异。sFlt-1转导组肿瘤切片的c-myc抗体表达强度低于G-292组和LacZ转导组,有显著性差异（p＜0.05）。结论1,在G-292组和LacZ转导组骨肉瘤样本中,实时定量PCR和免疫组织化学检测结果都证实了c-myc和c-fos原癌基因同VEGF一样具有高表达。表明这两种癌基因同骨肉瘤的生长发育密切相关。2,在sFlt-1转导组骨肉瘤样本中,c-myc原癌基因的表达低于G-292组和LacZ转导组,有显著性差异。提示骨肉瘤的生长抑制可能同c-myc原癌基因的下调表达具有关联性。