论文题目: 神经突起导向因子NETRIN-4与NNAT的相互作用及其表达相关性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 余利红
导师: 孙志贤,张成岗
关键词: 酵母双杂交,神经发育,突触形成
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 神经突起与其靶细胞之间精确联系的建立是由多种导向因子共同作用完成的。Netrin基因家族是此类因子的代表之一。本研究主要围绕该家族成员之一Netrin-4及其相互作用蛋白NNAT(Neuronatin)的结构、功能和表达变化特征进行系统分析。 本研究首先构建Netrin-4及其三个结构域的原核表达载体,用IPTG诱导得到相应的融合蛋白,并进一步采用合成肽制备抗Netrin-4特异性抗体。为了探讨Netrin-4发挥作用的分子基础,利用酵母双杂交技术从人胎脑cDNA文库中筛选并通过GST-pull down等实验鉴定出NNAT是其强相互作用蛋白,且证明Netrin-4的EGF重复结构域是Netrin-4与NNAT相互作用的重要结构。为了阐明功能尚属未知的NNAT蛋白与Netrin-4发生相互作用的意义,将NNAT与GFP融合表达,观察到NNAT蛋白在真核细胞中的表达存在核定位的现象,而流式细胞仪检测结果表明融合蛋白的过表达可导致细胞周期改变。进一步通过对所构建的能够稳定表达NNAT的工程细胞株的研究,发现NNAT蛋白仍然存在核定位和细胞周期阻滞现象。这些结果提示NNAT通过定位到细胞核中发挥其生物学功能,可能与细胞的增殖与分化的控制有关。利用RT-PCR技术检测Netrin-4和Nnat在11种细胞系和原代培养神经元中的表达情况,发现二者仅在神经元中有共表达,且在大脑发育的不同时期中Netrin-4和Nnat mRNA的表达特点不同,大鼠出生前后是Nnat表达的高峰期,Netrin-4出生后表达量变化不大。Netrin-4和Nnat在出生前后的高表达提示二者之间的相互作用可能与该时期神经发育过程及神经可塑性密切相关。 综上所述,本研究发现Netrin-4和Nnat都是在大脑发育过程中发挥重要作用的基因。Netrin-4除在发育初期发挥神经突起导向功能外,在大脑发育过程有可能通过与NNAT蛋白相互作用,共同影响突触及特定神经回路的形成。本研究为理解神经发育与分化过程中神经突起导向、神经可塑性的分子机制提供了新的数据。
论文目录:
目录
主要仪器设备
摘要
AbStract
第一章 Netrin-4基因克隆、蛋白表达及抗体制备
一、材料
二、方法
三、结果
四、讨论
第二章 Netrin-4相互作用蛋白的筛选及相互作用的验证
第一节 酵母双杂交筛选Netrin-4相互作用蛋白cDNA
一、材料
二、方法
三、结果
四、讨论
第二节 Netrin-4与Nnat相互作用的验证
一、材料
二、方法
三、结果
四、讨论
第三章 Nnat功能的初步探索
一、材料
二、方法
三、结果
四、讨论
第四章 Netrin-4和Nnat基因在不同细胞系和大鼠发育过程中表达的初步研究
一、材料
二、方法
三、结果
四、讨论
结论
致谢
攻读学位期间发表或投稿的文章
博士生期间负责及参与课题情况
专利申请
附录一 主要溶液的配制
附录二 综述：Neuronatin基因研究进展
附录三 论文：β-Netrin抗原表位的分析及抗体的制备与鉴定
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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