少根根霉脂肪酶基因的表达及定向进化研究

论文摘要

根霉脂肪酶是一类重要的脂肪酶，具有良好的1，3位置专一性和催化活性。少根根霉（Rhizopus arrhizus L-03-R-1）是经诱变选育的脂肪酶高产菌株。本论文克隆了该根霉脂肪酶基因，并在大肠杆菌和毕赤酵母中进行了表达。同时通过定向进化提高了脂肪酶的热稳定性。主要工作如下：1．以少根根霉（Rhizopus arrhizus L-03-R-1）的基因组DNA为模板PCR扩增了少根根霉前体脂肪酶（ProRAL）和成熟脂肪酶（RAL）基因（Genebank登录号：DQ489719）。对克隆的脂肪酶基因测序后发现，少根根霉脂肪酶基因与米根霉脂肪酶基因（Rhizopus oryzae．Genebank：AF229435）的基因同源性为96％，氨基酸序列的同源性为97％。这两种脂肪酶基因序列之间存在36bp的差异，翻译出的蛋白质存在10个氨基酸的差异。将RAL基因和大肠杆菌表达载体pET-28a（+）和pET-22b（+）连接构建了大肠杆菌表达质粒pET-28a-RAL和pET-22b-RAL。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现含有质粒pET-28a-RAL的重组大肠杆菌表达了重组蛋白，但是含有质粒pET-22b-RAL的重组大肠杆菌并没有观察到重组蛋白表达。表达产物菌没有检测到脂肪酶活性。2．将少根根霉ProRAL和RAL基因分别和毕赤酵母表达质粒pPIC9K连接，构建了重组酵母表达质粒pPIC9K-ProRAL和pPIC9K-RAL。酶切鉴定正确后分别使用SacⅠ和BglⅡ线性化质粒，然后电转化毕赤酵母GS115，得到了大约50000个重组子。通过YPD-Geneticin平板（2mg／ml G418）进行高拷贝筛选得到了56个高拷贝的毕赤酵母重组子。随机挑取12个转化子提取酵母基因组进行PCR鉴定表明脂肪酶基因已经整合到酵母基因组上。通过罗丹明脂肪酶活性筛选得到了8株产脂肪酶活性较高的菌株，同时在MD和MM平板上鉴定了所筛选菌株的表型。最后通过摇瓶筛选得到了两株表达量较高的重组酵母菌。在摇瓶中菌株BQ1（pPIC9K-ProRAL）和SC77（pPIC9K-RAL）产脂肪酶活性分别为18 U／mL和26U／mL。3．ProRAL和RAL的发酵液经过超滤、离子交换层析和疏水层析后，在SDS—PAGE上为单一条带，分子量分别为32kDa和30kDa。ProRAL和RAL纯化后的单位酶活分别为1543U／mg和2437U／mg，纯化得率分别为37％和37.7％。同时对纯化的ProRAL和RAL的糖基化、温度稳定性、pH稳定性以及底物特异性进行了研究。ProRAL和RAL均没有被糖基化。ProRAL和RAL的最适反应温度分别为30℃和35℃，最适反应pH值分别为8.0和8.5，ProRAL在酸性条件下活性更高，而RAL在碱性条件下活性更高。ProRAL的热稳定性略高于RAL。两种脂肪酶在pH7.0时都最稳定，pH＜7时ProRAL的稳定性要高于RAL，pH＞7时RAL的稳定性要高于ProRAL。ProRAL对三已酸甘油酯的活性最强，而RAL对三辛酸甘油酯的活性最强。脂肪酶前肽（Prosequence）序列的存在导致两种脂肪酶性质的差异。4．在5L发酵罐中对ProRAL和RAL的表达进行了研究。在溶氧控制下流加甲醇进行诱导表达，BQ1经过80h发酵脂肪酶活（ProRAL）达到72 U／mL，SC77经过92h发酵脂肪酶活（RAL）达到125 U／mL。由于在ProRAL序列中有1个Kex2蛋白酶的酶切位点，所以ProRAL是被加工过的蛋白产物，RAL在该培养条件下可能被糖基化。5．使用易错PCR和DNA该组技术在毕赤酵母系统中对RAL脂肪酶进行了定向进化研究。在50℃下使用橄榄油平板对大约5500个酵母重组子进行筛选得到了一个产脂肪酶热稳定较高的菌株。测序发现脂肪酶基因中有4个碱基被替换（G25A，A569T，A570T，G675C），推导出的氨基酸序列有3个氨基酸残基发生突变（A9T，E190V，M225I）。该突变脂肪酶最适反应温度比野生脂肪酶提高了10℃，在50℃下的T1╱2值是野生型的12倍。对野生脂肪酶定点突变发现E190（Ⅴ）位氨基酸的突变是导致脂肪酶最适反应温度和热稳定性提高的主要原因。同时模拟了脂肪酶的三维结构，尝试解释了突变脂肪酶最适反应温度和热稳定性提高的原因。6．以枯草芽孢杆菌B．subtilis 1.1390的基因组为模板PCR扩增了P43启动子和nprB信号肽（SP）基因，将这两个基因和RAL进行连接后构建了少根根霉脂肪酶基因分泌表达盒（P43+SP+RAL）。将该表达盒与穿梭质粒pGJ103连接后构建了枯草芽孢杆菌表达载体pGJ103-RAL。为少根根霉脂肪酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 脂肪酶
• 1.1.1 脂肪酶简介
• 1.1.2 脂肪酶的理化特性
• 1.1.3 脂肪酶的底物特异性
• 1.2 微生物脂肪酶
• 1.2.1 微生物脂肪酶来源
• 1.2.2 微生物脂肪酶的纯化
• 1.2.3 微生物脂肪酶的分子生物学
• 1.2.4 微生物脂肪酶的应用
• 1.3 根霉脂肪酶的研究进展
• 1.3.1 根霉脂肪酶的筛选与发酵
• 1.3.2 根霉脂肪酶的分子生物学研究
• 1.3.3 根霉脂肪酶的应用研究
• 1.4 微生物脂肪酶基因的表达
• 1.4.1 微生物脂肪酶基因在原核细胞中的表达
• 1.4.2 微生物脂肪酶基因在真核细胞中的表达
• 1.4.3 影响微生物脂肪酶基因表达的因素
• 1.5 酶分子的定向进化研究
• 1.5.1 酶分子定向进化简介
• 1.5.2 定向进化中文库构建的常用方法
• 1.5.3 定向进化在酶改造中的应用
• 1.6 本课题的设计思路和研究内容
• 第二章 少根根霉脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种与质粒
• 2.2.2 试验试剂及仪器设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 试验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 少根根霉基因组提取
• 2.3.2 ProRAL和RAL的PCR扩增
• 2.3.3 重组子的鉴定
• 2.3.4 测序结果分析
• 2.3.5 大肠杆菌重组子的鉴定
• 2.3.6 重组脂肪酶的表达
• 2.3.7 重组脂肪酶活性测定
• 2.4 小结
• 第三章 少根根霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达及筛选
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种与质粒
• 3.2.2 试验试剂及仪器设备
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 试验方法
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 重组质粒的鉴定
• 3.3.2 酵母重组子的筛选
• 3.3.3 酵母表型鉴定
• 3.3.4 重组酵母的PCR鉴定
• 3.3.5 酵母产脂肪酶活性筛选
• 3.4 小结
• 第四章 重组脂肪酶的纯化和性质鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 试验试剂及仪器设备
• 4.2.2 试验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组脂肪酶的纯化
• 4.3.2 重组脂肪酶的性质分析
• 4.4 小结
• 第五章 毕赤酵母发酵表达重组脂肪酶
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 试验试剂及仪器设备
• 5.2.3 培养基
• 5.2.4 试验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 溶氧控制甲醇流加的脂肪酶发酵
• 5.3.2 重组脂肪酶的性质分析
• 5.4 小结
• 第六章 少根根霉脂肪酶分子定向进化研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 菌种与质粒
• 6.2.2 试验试剂及仪器设备
• 6.2.3 培养基
• 6.2.4 试验方法
• 6.3 结果和讨论
• 6.3.1 重组酵母的鉴定
• 6.3.2 易错PCR体系的建立
• 6.3.3 DNA改组
• 6.3.4 产脂肪酶酵母突变体库的构建和筛选
• 6.3.5 突变脂肪酶的基因测序和分析
• 6.3.6 突变脂肪酶的性质鉴定
• 6.3.7 脂肪酶三维结构的模拟
• 6.3.8 脂肪酶的定点突变
• 6.3.9 突变脂肪酶热稳定提高的原因分析
• 6.4 小结
• 第七章 枯草芽孢杆菌分泌表达脂肪酶载体的构建
• 7.1 引言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 菌种与质粒
• 7.2.2 试验试剂及仪器设备
• 7.2.3 培养基和溶液
• 7.2.4 试验方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 枯草芽孢杆菌基因组的提取
• 7.3.2 枯草芽孢杆菌分泌达脂肪酶载体的构建
• 7.4 小结
• 第八章 结论
• 1 少根根霉脂肪酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 2 proRAL和RAL基因在毕赤酵母中的表达
• 3.ProRAL和RAL的纯化及性质分析
• 4.毕赤酵母发酵产proRAL和RA L
• 5.RAL的定向进化研究
• 6.枯草芽袍杆菌分泌表达脂肪酶载体的构建
• 本论文的创新点
• 问题与建议
• 附录
• 博士期间发表文章
• 致谢