唐菖蒲再生体系建立及NPR1基因的遗传转化

论文摘要

唐菖蒲（Gladiolus hybridus）是鸢尾科唐菖蒲属多年生单子叶球根花卉，是世界著名的四大切花之一。唐菖蒲的切花生产是以无性繁殖的方式生产球茎作为栽培材料，因此附着在球茎上的致病菌会不断传染给后代种球，经过多年积累导致种球种植过程中病害严重发生。应用抗病品种是病害防治最直接有效的方法，但唐菖蒲抗病种质资源匮乏加之常规育种周期长，使得抗病品种远远不能满足生产上的需求。随着生物技术的迅猛发展，运用基因工程手段将外源抗病基因导入植物中，为唐菖蒲抗病育种带来了新的希望。本研究在由唐菖蒲球茎芽诱导出的胚性愈伤组织基础上，建立了胚性愈伤组织经器官发生途径和经体细胞胚发生途径两套再生体系，并对器官发生途径中不定芽的壮苗培养和体细胞胚发生途径中胚状体的发育过程进行了较深入的研究。在此基础上以唐菖蒲愈伤组织为基因转化受体，将植物广谱抗病基因（NPR1基因）通过农杆菌介导转化唐菖蒲，建立了稳定的遗传转化体系，得到了经PCR检测为阳性的植株。本研究的主要结果如下：1．唐菖蒲愈伤组织经器官发生途径再生体系：以球茎芽切片为外植体，胚性愈伤组织诱导最佳培养基为MS+2，4-D4mg／L+6-BA0.5mg／L，诱导率达95％；不定芽诱导最佳培养基为MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.1mg／L，诱导率达92.7％；壮苗培养基为1／4MS+PP3331mg／L+NAA1mg／L+蔗糖50g／L，壮苗率达100％，生根培养基为MS+IBA1.5mg／L，生根率达100％，移栽成活率达100％。2．唐菖蒲愈伤组织经体细胞胚发生途径再生体系：以球茎芽切片为外植体，胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D4.0mg／L+6-BA0.5 mg门L；胚状体诱导培养基为MS+2，4-D1.0mg／L+TDZ0.2mg／L+蔗糖30g／L+甘露醇30g／L，诱导率为68.3％；将产生的胚状体首先接种于MS培养基使其充分发育，之后转入MS+6-BA2.0mg／L培养基中诱导发芽，在转入MS培养基中使其形成完整植株。通过石蜡切片法和临时压片法对胚状体的发育过程观察发现，首先外植体表层薄壁细胞经脱分化恢复分生能力，形成愈伤组织，随后在愈伤组织表面形成许多瘤状突起即胚性细胞团，胚性细胞团继续发育成球形胚、盾形胚，最后发育成熟形成完整植株。3．唐菖蒲遗传转化体系：以胚性愈伤组织为基因转化受体，将胚性愈伤组织预培养14天后用浓度为OD600=0.3～0.5的农杆菌菌液侵染10～15min，侵染的愈伤组织与农杆菌共培养3天后，用250mg／L的头孢霉素进行去菌培养，20天后用2.0mg／L的草甘磷（PPT）进行筛选培养直至抗性愈伤组织的产生。将产生的抗性愈伤组织分别经器官发生途径和体细胞胚发生途径进行再生。4．转化植株的PCR检测：经愈伤组织器官再生途径得到的69株抗性植株中有3株呈阳性，阳性率为4.3％，转化率为0.3％。经愈伤组织体细胞胚再生途径没有得到抗性植株。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 唐菖蒲抗病育种研究进展
• 1.2.2 唐菖蒲再生体系建立及遗传转化研究进展
• 1.2.3 植物广谱抗病的机理及其功能基因
• 1.2.4 广谱抗病基因NPR1的研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 分子生物学及生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 组织培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 唐菖蒲高频再生体系的建立
• 2.2.2 唐菖蒲遗传转化体系的建立
• 2.2.3 转化植株的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 唐菖蒲愈伤组织经器官发生途径再生体系的建立
• 3.1.1 胚性愈伤组织的诱导
• 3.1.2 不定芽的诱导
• 3.1.3 不定芽的壮苗培养
• 3.1.4 生根与移栽
• 3.2 唐菖蒲愈伤组织经体细胞胚发生途径再生体系的建立
• 3.2.1 胚性愈伤组织的诱导
• 3.2.2 体细胞胚的诱导
• 3.2.3 体细胞胚的继代
• 3.2.4 生根与移栽
• 3.3 唐菖蒲体细胞胚形成过程的组织学观察
• 3.4 唐菖蒲遗传转化体系的建立
• 3.4.1 愈伤组织生长曲线的测定
• 3.4.2 草甘磷选择压力的确定
• 3.4.3 抗菌素及其抑菌浓度的确定
• 3.4.4 农杆菌中质粒DNA的检测
• 3.4.5 影响转化效果因子的研究
• 3.4.6 植株再生
• 3.5 转化植株的PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 影响唐菖蒲愈伤组织经器官发生途径再生的因素
• 4.2 影响唐菖蒲愈伤组织经体细胞胚发生生途径再生的因素
• 4.2.1 外植体的选择
• 4.2.2 植物激素的配比
• 4.2.3 继代方式
• 4.3 影响农杆菌转化唐菖蒲的因素
• 4.3.1 基因转化受体材料的选择
• 4.3.2 预培养时间
• 4.3.3 转化体的再生培养基
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文