蛹拟青霉多糖生理功能和原生质体诱变的研究

论文摘要

蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link）是虫草属真菌的模式种,含有多种活性物质,具有增强免疫力、消炎、抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗突变、抗肿瘤等多种功效,已有研究表明其成分和功效不亚于著名的冬虫夏草,而且某些成分含量还高于冬虫夏草。另有研究证实蛹虫草无性型液体发酵的菌丝体成分与野生冬虫夏草的成分相近,具有与野生冬虫夏草相似的生理功效。在野生资源日益匮乏的情况下,研究开发人工虫草,选育优良虫草菌株,探讨液体发酵条件、研究菌丝体活性成分、含量及生理功能对进一步利用和开发虫草资源具有重要的理论意义和深远的现实意义。本研究以蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link）无性型——蛹拟青霉（Paecilomyces militaris（Kob.）Liang）为材料,利用正交实验研究了蛹虫草无性型液体发酵产胞、内外多糖和生物量的最佳条件;利用蚕豆根尖细胞微核实验探讨了虫草胞、内外多糖的抗突变特性;采用多糖喂食果蝇并利用试剂盒测定其体内SOD、MDA的含量,分析了乙醇分级多糖对果蝇体内SOD和MDA含量的影响,同时通过测定多糖对羟自由基、超氧自由基和有机自由基DPPH的清除能力,确定乙醇分级多糖的抗氧化性能;研究了蛹虫草原生质体的形成和再生条件,并以原生质体诱变的方法对多糖高产菌株进行了选育,为进一步开发利用虫草资源奠定了理论基础。研究结果表明:1、蛹虫草液体发酵条件蛹虫草菌丝体液体深层发酵产胞内、外多糖及菌丝体产量最佳培养基为:蔗糖5.0%,玉米浆2.0%,酵母浸出汁0.03%,KNO30.08%,KH2PO40.25%,NH4NO30.04%,FeSO4·7H2O 0.08%,MgSO4·7H2O 0.15%;最佳培养条件为:温度22℃;接种量10%-15%,pH 6.0,深层发酵5 d。每100 mL发酵液得到胞内多糖为170.3 mg,胞外多糖为114.8 mg,菌丝体干重为546 mg。2、蛹虫草胞内、外多糖的组成成分均为:葡萄糖、半乳糖和甘露糖。3、蛹虫草胞内、胞外多糖对化学因素的抗突变作用（1）蛹虫草胞内、胞外多糖均可有效抑制丝裂霉素诱导的蚕豆根尖细胞微核的产生,且在实验浓度内有正向剂量-效应关系。在胞内、胞外多糖实验浓度为100μg/mL时抑制微核产生的效果最佳,其蚕豆根尖细胞微核抑制率分别为60.48%和62.20%。（2）蛹虫草胞内、外多糖对环磷酰胺诱导的蚕豆根尖细胞微核具有显著的抑制作用,其抑制作用随着多糖浓度的升高而增强,当胞内、外多糖实验浓度为100μg/mL,对环磷酰胺诱导的蚕豆根尖细胞微核的抑制率分别为53.52%和52.11%,虫草多糖具有显著的抑制突变作用。4、蛹虫草胞内、胞外多糖对物理因素的抗突变作用蛹虫草胞内、外多糖均可有效抑制由紫外线照射所诱发的蚕豆根尖细胞微核的产生,且在实验浓度范围内存在一定的正向剂量-效应关系。当蛹虫草胞内、外多糖浓度为100μg/mL时对蚕豆根尖细胞微核的抑制率分别达到了47.68%和43.04%。5、蛹虫草醇沉分级多糖的抗氧化作用（1）70%的乙醇醇沉虫草多糖量最多,可使胞内、外多糖的得率分别为1.513 mg/mL和0.483 mg/mL。（2）不同浓度的乙醇醇沉虫草胞外多糖均具有较好的抗氧化性。可以提高果蝇体内的SOD含量,降低MDA含量,70%的乙醇醇沉虫草胞外多糖可以使果蝇体内SOD含量比对照组高13.13%;使果蝇体内的MDA含量比对照组低67.2%,且多糖添加量为2%的比1%的抗氧化效果好。（3）50%乙醇醇沉虫草胞内多糖具有较好的DPPH清除作用,当多糖浓度为1mg/mL时,37℃,20 min,DPPH清除率可达93.4%;虫草胞内多糖具有一定的清除羟自由基的能力,但效果不是很好,当多糖浓度为0.1 mg/mL,37℃,30 min,50%的醇沉多糖对羟自由基的清除率可达47.5%;虫草多糖清除超氧自由基的能力很弱,当多糖浓度为0.1 mg/mL,37℃,20 min,50%的醇沉多糖对超氧自由基的清除率为27.3%。6、蛹虫草醇沉分级多糖的抗菌性70%乙醇醇沉虫草胞内多糖抗菌性好于胞外多糖,可使黑曲霉的抑菌圈直径达8.6 mm,大肠杆菌的抑菌圈直径达11.7 mm。70%乙醇醇沉胞内、外多糖的抑菌效果均好于50%和30%的胞内外多糖。7、蛹虫草原生质体制备条件在蜗牛酶和纤维素酶混合的酶解液中,蜗牛酶酶解液的最佳浓度为1%,纤维素酶的最佳浓度为0.5%,蜗牛酶酶解液和纤维素酶酶解液的最佳体积比是1:2,最佳酶解温度为35℃,最佳酶解时间为3 h,最佳酶解pH为6.5。在以上的条件下,原生质体的制备率为1.36×108个/mL。8、蛹虫草原生质体再生条件渗透压稳定剂在实验材料内甘露醇最好,甘露醇浓度为0.6 mol/L时原生质体的再生率最高0.658%;最佳酶解时间为2.5 h,原生质体再生率为5.68‰;双层平板法好于单层平板法;在最佳条件下的再生率为8.8‰。9、高生物量、高产多糖菌株的选育经紫外线诱变原生质体得到2株突变株0704号和0706号,两菌株的生物量产量和胞内、外多糖产量均较高,其生物量分别是出发菌株的2.26倍和2.19倍;这两株菌的胞内、外多糖产量也比较高,分别比出发菌株高32%、70.1%和28.1%、50.51%;0704号和0706号菌株的胞内、外多糖分别达到214.8 mg/100mL、198.7 mg/100mL和208.5 mg/100mL、175.8 mg/100mL。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 综述
• 1.1 蛹虫草研究概况
• 1.1.1 蛹虫草及无性型的分类地位
• 1.1.2 虫草无性型的分离
• 1.1.3 蛹虫草的生态特征
• 1.1.4 蛹虫草的寄主
• 1.1.5 蛹虫草的生活史
• 1.1.6 蛹虫草的化学成分
• 1.1.7 蛹虫草多糖生理功能
• 1.1.8 虫草多糖的提取方法
• 1.1.9 蛹虫草的液体培养
• 1.2 真菌多糖抗氧化作用
• 1.3 真菌多糖抗突变作用
• 1.4 原生质体诱变育种
• 第二章 引言
• 第三章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌种及其材料来源
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要仪器和试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 菌株活化
• 3.2.2 菌丝液体深层发酵正交实验
• 3.2.3 液体种子及摇瓶发酵培养
• 3.2.4 菌丝体深层发酵时间因素实验
• 3.2.5 菌丝体生物量测定
• 3.2.6 胞内、外多糖的提取方法
• 3.2.7 分级醇沉多糖的方法
• 3.2.8 多糖除杂蛋白方法
• 3.2.9 虫草多糖测定方法
• 3.2.10 虫草多糖组分测定
• 3.2.11 蚕豆根尖细胞微核测定方法
• 3.2.12 果蝇的培养方法
• 3.2.13 果蝇的处理方法
• 3.2.14 虫草多糖抗菌性的测定方法
• 3.2.15 果蝇组织中可溶性蛋白含量的测定方法
• 3.2.16 果蝇总超氧化物歧化酶活力的测定方法
• 3.2.17 果蝇体内丙二醛含量的测定方法
• 3.2.18 虫草乙醇分级多糖对羟自由基清除作用
• 3.2.19 虫草乙醇分级多糖对超氧阴离子自由基清除作用
• 3.2.20 虫草乙醇分级多糖对DPPH清除作用
• 3.2.21 原生质体的制备
• 3.2.22 原生质体的再生
• 3.2.23 原生质体的紫外线诱变
• 第四章 结果与分析
• 4.1 蛹虫草无性型液体发酵产生物量和胞内、外多糖最佳条件的研究
• 4.1.1 培养基、温度、pH、接种量对蛹虫草菌丝体产量的影响
• 4.1.2 培养基、温度、pH、接种量对蛹虫草胞内多糖产量的影响
• 4.1.3 培养基、温度、pH、接种量对蛹虫草胞外多糖产量的影响
• 4.1.4 发酵时间对蛹虫草菌丝体、胞内、外多糖产量的影响
• 4.1.5 蛹虫草胞内、外多糖组分
• 4.2 蛹虫草多糖活性研究
• 4.2.1 蛹虫草胞内、外多糖对化学诱变剂和物理诱变剂诱发突变的影响
• 4.2.2 虫草乙醇分级多糖抗氧化作用
• 4.2.2.1 乙醇浓度对胞内、外多糖得率的影响
• 4.2.2.2 蛹虫草乙醇分级胞外多糖对果蝇体内SOD含量的影响
• 4.2.2.3 蛹虫草乙醇分级胞外多糖对果蝇体内MDA含量的影响
• 4.2.2.4 虫草乙醇分级胞内多糖对DPPH的清除作用
• 4.2.2.5 蛹虫草乙醇分级胞内多糖对羟自由基的清除作用
• 4.2.2.6 蛹虫草乙醇分级胞内多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
• 4.2.3 蛹虫草多糖的抗菌性
• 4.3 蛹虫草原生质体诱变研究
• 4.3.1 原生质体制备条件
• 4.3.2 原生质体再生条件
• 4.3.3 蛹虫草原生质体紫外线诱变选育高生物量、高产多糖菌株
• 第五章 讨论
• 5.1 培养基、温度、PH、接种量、培养时间对蛹虫草菌丝体、胞内、外多糖产量的影响
• 5.2 蛹虫草胞内、外多糖组分
• 5.3 蛹虫草多糖活性研究
• 5.3.1 蛹虫草胞内、外多糖对理、化诱变剂诱发蚕豆根尖细胞微核的影响
• 5.3.2 蛹虫草乙醇分级多糖抗氧化作用
• 5.3.3 蛹虫草多糖的抗菌性
• 5.4 蛹虫草原生质体的诱变研究
• 5.4.1 蛹虫草原生质体的制备
• 5.4.2 蛹虫草原生质体的再生
• 5.4.3 高生物量、高产多糖菌株的选育
• 第六章 结论
• 6.1 蛹虫草液体发酵条件
• 6.2 蛹虫草胞内、外多糖组成成分
• 6.3 蛹虫草胞内、胞外多糖的活性
• 6.3.1 蛹虫草胞内、胞外多糖对化学因素的抗突变作用
• 6.3.2 蛹虫草胞内、胞外多糖对物理因素的抗突变作用
• 6.3.3 蛹虫草醇沉分级多糖的抗氧化性
• 6.3.4 蛹虫草醇沉分级多糖的抗菌性
• 6.4 蛹虫草原生质体制备条件
• 6.5 蛹虫草原生质体再生条件
• 6.6 高生物量、高产多糖菌株的选育
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 在硕士学习期间发表的论文