核盘菌菌核形成相关基因的筛选及功能验证

论文摘要

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary）是一种重要的世界性植物病原真菌。该菌的寄主范围非常广泛,能侵染75科450种植物。菌核在核盘菌病害循环中扮演着重要的角色,它作为初侵染源侵染农作物引起病害的发生。本实验从核盘菌表达谱中筛选出菌核形成相关基因Ss-MFS并进行了功能验证,研究结果如下,1.以实验室核盘菌表达谱为基础筛选出一个与菌核形成相关的基因Ss-MFS （SS1G02358, XP001596142）,该基因全长2196 bp,编码521个氨基酸,含有14个跨膜结构,为跨膜蛋白；含有MFS和effllux-EmrB两个保守结构域,为MFS转运体。Real-time PCR分析发现该基因在菌丝生长的1-2d表达量很低,而从第3d开始表达量急剧上升,到第7d时达到顶峰,该基因表达量的变化与核盘菌菌核形成过程相符。2.构建了沉默载体sipCH并完成了农杆菌介导转化核盘菌,通过潮霉素抗性筛选初步得到了22个候选转化子,进一步对部分转化子进行潮霉素基因（HPH）PCR验证,证明全部含有插入片段。利用Real-time PCR证实转化子A8、A9和B49中Ss-MFS基因的表达下降,下降幅度为50-80%,说明这些转化子已达到沉默效果。对这些转化子进行生物学实验后发现,转化子普遍生长缓慢,在PDA和胡萝卜培养基上产菌核能力也明显下降。接种离体油菜叶片后,发现这些转化子的致病力也受到不同程度的抑制,其中转化子A8、A9和B49完全不致病,而且也不能形成菌核。产酸实验研究发现,转化子都可以产生酸性物质（草酸）,说明产菌核能力和致病力的下降与草酸没有关系。转化子A8、A9和B49在不同碳源培养基上生长均受到抑制,表明其对不同碳源的利用无选择性,可能是受到其它营养物质的影响。本研究证实了当核盘菌基因Ss-MFS表达受到抑制时其产菌核能力也下降,因此推测该基因的表达可能与菌核形成相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.核盘菌研究进展
• 1.1 核盘菌基本特性及其危害
• 1.2 菌核及其形成机理
• 1.2.1 菌核特性
• 1.2.2 菌核形成过程
• 1.2.3 影响菌核形成的因素
• 2 基因功能的研究方法
• 2.1 正向遗传学和反向遗传学
• 2.2 基因功能的预测与分析
• 2.2.1 序列分析
• 2.2.2 基因表达分析
• 2.2.3 基因的功能预测
• 2.2.4 基因功能的实验验证
• 3 RNAI在基因功能研究中的应用
• 3.1 RNAi技术的研究背景
• 3.2 RNAi的分子机制
• 3.3 siRNAs的获得途径
• 3.4 RNAi技术在真菌基因功能研究上的应用
• 4 跨膜转运体—MFS
• 5 本实验的目的及意义
• 第二章 核盘菌菌核形成相关基因的筛选及基因SS-MFS沉默载体的构建
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 质粒及质粒抽提用溶液
• 1.1.4 其它溶液及试剂
• 1.1.5 限制性内切酶、试剂盒及其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌核形成相关基因的筛选
• 1.2.2 核盘菌Ss-MFS基因的序列分析
• 1.2.3 核盘菌Ss-MFS基因的表达动态
• 1.2.4 核盘菌基因组DNA的提取
• 1.2.5 沉默片段的克隆
• 1.2.6 PCR产物回收纯化
• 1.2.7 目的片段与克隆质粒连接
• 1.2.8 重组质粒的热击转化
• 1.2.9 重组质粒的筛选、鉴定和质粒提取
• 1.2.10 基因Ss-MFS沉默载体的构建
• 1.2.11 重组质粒农杆菌热击转化
• 1.2.12 农杆菌重组质粒的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌核形成相关基因Ss-MFS的筛选
• 2.2 丛因Ss-MFS的序列分析
• 2.3 核盘菌Ss-MFS基因的表达动态
• 2.4 基因Ss-MFS沉默片段的克隆、回收及鉴定
• 2.5 基因Ss-MFS沉默载体的构建
• 2.6 含重组质粒农杆菌转化及验证
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 第三章 核盘菌遗传转化及SS-MFS基因功能的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及载体
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 农杆菌介导转化用培养基及培养液
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌介导的核盘菌遗传转化
• 1.2.2 转化子ITS验证
• 1.2.3 转化子PCR鉴定
• 1.2.4 转化子生物学特性分析
• 1.2.5 转化子寄生胡萝卜产菌核能力的检测
• 1.2.6 转化子产酸能力的检测
• 1.2.7 转化子致病力的测定
• 1.2.8 利用半定量RT-PCR分析转化子Ss-MFS基因的表达情况
• 1.2.9 利用Real-time PCR分析转化子Ss-MFS基因的表达
• 1.2.10 转化子在不同碳源培养基上的生长情况测定
• 1.2.11 实验数据的处理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 转化子ITS验证
• 2.2 转化子PCR鉴定
• 2.3 转化子形态特征观察
• 2.4 转化子中Ss-MFS基因的表达检测
• 2.5 转化子显微形态观察
• 2.6 转化子生长速度的测定
• 2.7 转化子产菌核能力的测定
• 2.8 转化子寄生胡萝卜产菌核能力的检测
• 2.9 转化子致病力的测定
• 2.10 转化子产酸能力的测定
• 2.11 转化子在不同碳源培养基上的生长情况测定
• 3 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢