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人血清白蛋白/人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达

2020-12-01阅读(873)

人血清白蛋白/人白介素-11在毕赤酵母中的克隆与表达

论文摘要

人白介素-11（Interleukin-11,IL-11）在体内由PU-34细胞产生,具丝裂原活性、能支持IL-6依赖的浆细胞瘤细胞系T1165生长。最基本的功能在于造血调控作用,在体外对不同阶段的巨核细胞和血小板生成都具有特异的促进作用。体内注射hIL-11可显著刺激巨核细胞集落（CFU-MK）生长和增加血小板计数,还具有促进消化道上皮损伤恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。但是天然的白介素-11在在体内的半衰期较短,为了达到延长其在体内的半衰期,本研究采用了把白介素-11和人血清白蛋白以无连接肽的方式融合。取人胎肺成纤维细胞,以DMEM刺激培养,提取总RNA,通过反转录得到编码人白介素-11的cDNA,克隆到T载体pMD19-Simple上,构建含有IL-11编码基因的重组质粒pMD19/IL-11,DNA序列测定结果证明插入序列与IL-11编码序列完全一致。分别以pMD19/IL-11和含有编码HSA编码基因的重组质粒pBlue/HSA为模板,利用重叠PCR的办法,扩增得到HSA-IL-11融合基因,连接到载体上得到重组质粒pBlue/HI;对pBlue/HI和穿梭质粒pPIC9K分别用EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切,将HSA-IL-11融合基因克隆到表达质粒pPIC9K中构建重组表达质粒pPHI11;经测序验证,所得到的表达载体中目的片段碱基序列和预期一致,读框正确。将SalⅠ线性化的pPHI11电转化巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,通过组氨酸缺陷型标记和G418抗性筛选,得到抗0.75 mg/mL的G418的毕赤酵母转化子,经过PCR验证,转化子中含有HSA-IL-11融合基因。BMGY种子培养基培养细胞,经离心收集后,于BMMY诱导表达培养基在30℃,200 r/min条件下,以甲醇为唯一碳源诱导3 d,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测,重组子表达出相应分子量的目标蛋白,HSA及IL-11抗体的Western-blot免疫杂交实验检测结果表明,融合蛋白中含有HSA和IL-11,说明HSA-IL-11融合蛋白得以表达。定量测定结果表明,融合蛋白在诱导上清液中的表达量约为120 mg/L。对重组菌在摇瓶转速、诱导甲醇浓度、诱导时间、诱导pH、诱导温度等条件下进行优化,得到的诱导条件为:诱导温度30℃,甲醇浓度5%,pH6,诱导细胞密度O.D.600=60,在上述优化条件下HSA-IL-11的表达量为198 mg/L。B9-11/MTT法检测诱导上清液生物学活性的结果表明,融合蛋白HSA-IL-11可以有效刺激B9-11细胞增殖,其IL-11生物学活性约为6.2×104 U/mg。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 研究背景
  • 1.1.1 人白介素-11 的发现
  • 1.1.2 IL-11 的分子生物学特性
  • 1.1.3 IL-11 的生物学作用
  • 1.1.4 IL-11 的临床作用
  • 1.2 人血清白蛋白的研究
  • 1.2.1 人血清白蛋白的分子生物学特性
  • 1.2.2 重组人血清白蛋白在药学中的应用
  • 1.2.3 重组人血清白蛋白的表达系统
  • 1.3 长效药物研究
  • 1.3.1 我国生物技术药物研究概况
  • 1.3.2 国际生物技术药物概况
  • 1.3.3 长效药物研究途径
  • 1.3.4 长效药物应用前景
  • 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统
  • 1.4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的特点
  • 1.4.2 表达型巴斯德毕赤酵母宿主菌株
  • 1.4.3 巴斯德毕赤酵母表达载体
  • 1.4.4 影响外源蛋白表达的主要因素
  • 1.4.5 巴斯德毕赤酵母表达系统的应用前景
  • 1.5 本课题的研究思路与内容
  • 1.5.1 课题研究思路
  • 1.5.2 研究内容
  • 第二章 人血清白蛋白和白介素-11 编码基因融合载体的构建
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 人胎肺细胞、菌株与质粒
  • 2.2.2 培养基
  • 2.2.3 工具酶、试剂和缓冲液
  • 2.2.4 主要仪器
  • 2.2.5 XL-1-Blue 感受态细胞的制备以及转化
  • 2.2.6 原代胎肺成纤维细胞的制备及诱导
  • 2.2.7 总RNA 的提取及RT-PCR 合成IL-11cDNA
  • 2.2.8 IL-11 编码基因的克隆
  • 2.2.9 获得编码HSA-IL-11 的基因及其克隆
  • 2.2.10 重组表达质粒pPH111 的构建及其序列测定
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 融合蛋白HSA-IL-11 表达载体pPH111 构建
  • 2.3.2 含有IL-11cDNA 序列的重组载体pMD19/IL-11 的构建
  • 2.3.3 融合基因HSA-IL-11 的拼接
  • 2.3.4 重组质粒pBlue/HI 的构建
  • 2.3.5 表达质粒pPH111 的构建
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 重组酵母P. PASTORIS G5115/PPH111 的构建
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 菌株、质粒和培养基
  • 3.2.2 工具酶、试剂与缓冲液
  • 3.2.3 主要仪器
  • 3.2.4 线性化融合表达质粒pPH111 和pPIC9K
  • 3.2.5 重组菌P. pastoris GS115/pPH111 的构建
  • 3.2.6 高拷贝重组子P. pastoris GS115/pPH111 的筛选
  • 3.2.7 重组子P. pastoris GS115/pPH111 的PCR 鉴定
  • 3.2.8 重组子的Mut 表型鉴定
  • 3.2.9 重组子P. pastoris GS115/pPH111 的诱导表达
  • 3.2.10 表达产物的Western-blot 鉴定
  • 3.2.11 融合蛋白测定方法
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 重组毕赤酵母P. pastoris GS115/pPH111 的构建与筛选
  • 3.3.2 重组毕赤酵母P. pastoris GS115/pPH111 的鉴定
  • 3.3.3 重组菌的Mut 表型鉴定
  • 3.3.4 高表达P. pastoris GS115/pPH111 的筛选
  • 3.3.5 融合蛋白的Western-blot 鉴定
  • 3.4 讨论
  • 3.5 本章小结
  • 第四章 P. PASTORIS GS115/PPH111 诱导条件的初步优化
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 菌种与细胞
  • 4.2.2 培养基
  • 4.2.3 主要仪器
  • 4.2.4 主要试剂
  • 4.2.5 摇瓶诱导条件的优化
  • 4.2.6 融合蛋白HSA-IL-11 的测定
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 菌体生长阶段溶氧对表达的影响
  • 4.3.2 甲醇浓度对表达的影响
  • 4.3.3 pH 对表达的影响
  • 4.3.4 诱导时间对表达的影响
  • 4.3.5 诱导温度对表达的影响
  • 4.3.6 初步优化后融合蛋白的表达
  • 4.3.7 融合蛋白的生物活性
  • 4.4 本章小结
  • 第五章 主要结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 相关论文文献

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