鸡传染性支气管炎病毒河南地方株分离鉴定及HN104株与HN091株全基因组序列测定

论文摘要

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。主要引起鸡支气管、气管、肾脏、输卵管、腺胃、肠道等病变,在饲养环境差的情况下,易引起大肠杆菌、支原体等继发感染而提高鸡群的发病死亡率,导致产蛋鸡的生产性能降低。单一疫苗免疫很容易失败,给世界养禽业带来巨大损失。为此,掌握河南省养鸡业中IBV流行变异株的分子特征有利于IB的检测防控工作。本试验鉴定了20082010年自河南开封、新密、许昌、新郑、荥阳等市县分离的7株IBV毒株,代号分别为HN081、HN082、HN091、HN092、HN101、HN102和HN104。将分离株进行910日龄SPF鸡胚尿囊腔接种后收集尿囊液进行常规细菌、血凝试验检测阴性后、用RT-PCR方法扩增IBV Sl与N基因。对分离株HN104尿囊液用新配制l%胰酶处理尿囊液后血凝滴度为28,EID50为10-5.5/0.1ml,对NDV在鸡胚增值产生干扰作用,动物回归试验显示:HN104株可致SPF雏鸡出现呼吸道和“花斑肾”症状。通过对4株河南分离株进行S1基因的序列测定,核苷酸同源性在77.496.9%,与39株参考IBV同源性为76100%,并且构建进化树,分离株HN104与HN082为基因I型属于近10多年优势流行致肾病变LX4基因型;HN091为基因III型属于台湾独特TW2296/95型基因型毒株;HN092为基因II型与疫苗株型M41核苷酸同源性高为99%,可能是免疫压力下变异的疫苗株。除HN092外的其它3株分离毒与美国Mass型疫苗株、澳大利亚T株、欧洲4/91株亲缘关系远低于78%。对N基因进化树分析6株分离株中5株属LX4基因型。通过对2009年分离的HN091株和2010年分离的HN104株进行全基因组序列测定和分析,其基因组全长序列和各个基因均表现出与国内分离株较高的相似性。HN091与HN104分离株与已报道的12株全基因代表性毒株的各基因同源性比较分析,发现全基因组中最保守的是非结构基因5b,变异最大是非结构基因3b;5’UTR与病毒起始复制起重要作用非常保守同源性92.099.8%。3’UTR变异大同源性59.199.5%,3’UTR缺失的大片段可能有利于病毒复制与发转录。HN091分离株是一自然重组株,其S1基因重组于台湾独特基因型TW2575/98型毒株,3a、3b基因重组与广西GX-YL5型毒株,HN091全基因主体于另一河南分离株HN104型毒株同源性高,推断是不同毒株基因重组或点突变的结果。HN104株全基因与2007年四川德阳分离株DY07同源性高达95%;通过对HN104的每个基因与5’UTR与3’UTR进行BLAST检索及系统进化树分析表明HN104株是DY07遗传演化的结果。河南是养禽业大省,地处中原交通便利,也为IB的传播流行提供了前提条件。研究表明,河南省鸡群中IBV存在多种基因型变异病毒,本次试验分离出大多是中国最流行LX4基因型毒株。河南分离株HN104与HN091全基因扩增为进一步研究IBV变异分子机制及为IBV反向遗传操作构建奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 禽传染性支气管炎进展
• 1.1 病原分类
• 1.2 理化特性
• 1.3 生物学特性
• 1.4 宿主系统
• 2 IB 的流行病学研究进展
• 2.1 IB 不同致病型的研究
• 2.2 IB 的流行病学
• 2.2.1 国外IB 的流行病学
• 2.2.2 国内IB 的流行病学
• 3 IB 的检测方法
• 3.1 血清学检测
• 3.2 病原学检测
• 3.3 分子生物学检测
• 4 IBV 的分子生物学研究
• 4.1 IBV 基因组
• 4.2 IBV 的结构蛋白基因与生物学功能
• 4.3 IBV 的非结构蛋白基因与生物学功能
• 4.4 IBV 51 基因研究进展
• 4.4.1 高变区和保守区与抗原决定簇
• 4.4.2 血清型
• 4.4.3 毒力与组织嗜性
• 引言
• 试验一 河南部分地区鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及分子流行病学研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 SPF 种蛋及SPF 鸡
• 1.1.3 病料来源及7 株分离株背景
• 1.1.4 主要试剂及配制
• 1.1.5 酶和主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 病料处理与病毒培养
• 1.2.2 HA 试验
• 1.2.3 侏儒胚试验
• 1.2.4 l%胰酶处理HN104 株鸡胚尿囊液试验
• 1.2.5 HN104 株对NDV-LaSota 株干扰试验
• 1.2.6 HN104 株EID50 测定
• 1.2.7 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验
• 1.2.8 RT-PCR 试验
• 1.2.8.1 引物的设计与合成
• 1.2.8.2 病毒总RNA 的提取及RT-PCR
• 1.2.8.3 第一链cDNA 合成
• 1.2.8.4 基因的PCR 扩增
• 1.2.9 基因的克隆与序列测定
• 1.2.9.1 PCR 产物的回收与纯化
• 1.2.9.2 PCR 纯化产物与载体的连接
• 1.2.9.3 连接产物转化于感受态细胞
• 1.2.9.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验
• 1.2.9.5 IBV Sl 序列的测定及序列比较分析
• 2 结果与分析
• 2.1 侏儒胚试验
• 2.2 胰酶处理HN104 株尿囊液后HA 试验及EID50 测定
• 2.3 HN104 株对NDV 干扰试验
• 2.4 HN104 株对SPF 鸡的致病力试验
• 2.5 分离株的Sl 与N 基因核苷酸序列Blast 检索结果
• 2.6.S1 基因序列分析及遗传进化分析
• 2.6.1 S1 基因序列分析
• 2.6.2 Sl 基因的遗传进化分析
• 2.7 N 基因序列分析及遗传进化分析
• 2.7.1 N 基因序列分析
• 2.7.2 N 基因遗传进化分析
• 2.8 HN104 株Sl 基因分子特征分析
• 3 结论与讨论
• 试验二 IBV 分离株HN104 与HN091 全基因组序列测定及遗传进化分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 酶和主要试剂
• 1.1.3 毒株和SPF 种蛋
• 1.1.4 细胞培养相关试剂的配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 病毒的纯化与增殖
• 1.2.2 分子生物学软件
• 1.2.3 分段扩增IBV 全基因组17 对引物的设计与合成
• 1.2.4 常规分子实验
• 1.2.4.1 病毒基因组RNA 的提取方法
• 1.2.4.2 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4.3 基因的克隆与序列测定
• 1.2.5 IBV 全基因组的5’端和3’端扩增
• 1.2.5.1 IBV 全基因组的5’端RACE 扩增
• 1.2.5.2 IBV 全基因组的3’端RACE 扩增
• 1.2.6 IBV 全基因组全长cDNA 序列的测定及序列比较分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RT-PCR 扩增结果
• 2.2 基因组cDNA 序列的测定与BLAST 分析
• 2.3 部分分离株IBV 全基因组序列分析
• 2.3.1 IBV HN104 株全基因组序列特点
• 2.3.2 IBV HN091 株全基因组序列特点
• 2.3.3 分离株HN104 和HN091 全基因遗传进化分析
• 2.4 分离株HN104 和HN091 的各个编码基因片段序列比较及遗传进化分析
• 2.5 5’UTR 与3’UTR 结构基因片段的序列比较及遗传进化分析
• 3 结论讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录