论文摘要
Erbin（ErbB2 interacting protein）可通过其PDZ结构域介导ErbB2定位到上皮细胞基底外侧膜。为了深入研究Erbin PDZ结构域的配体识别特性，本实验以ErbinPDZ为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统来筛选新型随机多肽文库。研究发现，除了报道的Ⅰ类配体-[E／D]-[T／S]-W-V之外，Erbin PDZ还可识别属于Ⅱ类的-E-[V／A]W-V和Ⅲ类的-D-E-W-V。在配体-1位，除了报道的芳香族氨基酸之外，酸性的E或D也可被识别。实验同时得到了高亲和力的ETWV配体，也发现了低亲和力的ESDV。综合分析所有得到的阳性克隆，发现其在C-末端呈现规律。利用规律搜索Swiss-Prot数据库预测Erbin PDZ潜在的天然配体。经过初步验证，得到了4个新的天然配体，为深入研究Erbin PDZ的功能提供了线索。上述结果表明用酵母双杂交一次筛选随机多肽文库既可以全面研究Erbin PDZ结构域的结合特性，又可以在全蛋白质组水平上找到表达于不同组织的天然配体。大多数蛋白与蛋白之间的相互作用是由结合短肽的结构域介导的。全面了解蛋白相互作用结构域的识别特性有利于了解蛋白相互作用机制及相互作用网络。现有的高通量研究结构域识别特性的方法都需要对每个结构域进行大规模筛选，工作量巨大。为了提高研究效率，我们提出了一种验证筛选配体库的策略。先用目的结构域家族中有代表性的成员筛选随机多肽文库，收集得到的阳性克隆构建成一个配体库，其他的成员直接验证筛选这个配体库来研究它的识别特性。根据得到的识别规律在蛋白质数据库寻找潜在的配体。如果直接验证筛选配体库得到的克隆不足以总结某个结构域的识别特性，该结构域就从头筛选随机多肽文库，得到的新克隆添加到配体库，是对配体库的补充。另外在验证预测的天然配体时，构建的克隆也是对配体库的重要补充。这样一次筛选就有可能找到天然配体。验证筛选配体库的优点是与传统筛选相比，研究效率得到了很大提高。而且整个体系是动态发展的，配体库会在研究过程中得到补充，扩充了的配体库又会进一步提高研究效率。我们首先将该策略用于PDZ结构域的研究。收集Erbin PDZ、ZO-1 PDZ1、ZO-1PDZ3及GIPC PDZ筛选随机多肽文库得到的阳性克隆构建成一个初始的配体库，利用该配体库很快研究了Densin-180 PDZ、HtrA2 PDZ、LNX1 PDZ1、LNX1 PDZ2等的识别特性。RGS3 PDZ用这个初始的配体库不能得到满意的结果，从头筛选随机多肽文库得到了新的配体，是对配体库的补充。研究发现了一些新的配体识别特性，为PDZ结构域的重新分类提供了线索。实验找到了一些新的天然配体，为深入功能研究提供了线索。发现的一些非天然配体可以为药物分子的设计提供依据。该策略可尝试扩展到其他识别短肽的结构域识别特性的研究。SH2结构域特异性识别磷酸化的酪氨酸（Y）及其C-末端的3～6个氨基酸残基。研究SH2结构域的识别特性有利于了解磷酸化酪氨酸调控的信号转导通路。由于酵母缺乏酪氨酸磷酸化修饰，本研究尝试用修饰的酵母双杂交（下称三杂交）筛选随机多肽文库来研究SH2结构域的识别特性。将SH2结构域克隆到酵母双杂交pBridge载体的多克隆位点Ⅰ，将Abl激酶结构域克隆到受PMET25启动子调控的多克隆位点Ⅱ。在缺乏Met的培养基中多克隆位点Ⅱ的Abl激酶结构域表达，并可能磷酸化文库中的酪氨酸。利用该系统初步筛选了Abl SH2结构域和Grb14 SH2结构域。Abl SH2结构域只得到了一个阳性克隆，含有的序列为YEIF。Grb14 SH2结构域筛选随机多肽文库得到了20个非冗余阳性克隆，其中表达的序列含有Y的克隆有13个，另外7个克隆不表达Y，但有S或T。含有Y的序列可总结为Y-x-x-[basic／ST]和Y-φ-x-φ（φ是疏水性氨基酸）两种规律，其中Y-x-x-[basic／ST]可能是Grb14特有的识别规律。把没有Y序列中的S或T突变成A，依然表现为阳性相互作用，说明作用位点可能与S或T无关。实验可能因为引入的Abl激酶结构域不能广泛磷酸化，或者磷酸化的靶点不能满足研究的SH2结构域的需要，筛选得到的阳性克隆比较少，不能很好地总结出识别规律。结果表明用本实验构建的酵母三杂交系统研究SH2结构域的识别特性有一定的局限性，需要进一步改进。
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