大豆GmNHX1基因的克隆、功能初探及遗传转化

论文摘要

大豆[Glycine max（L.）Merrill]是重要的油料作物和粮食作物,是世界上食用油和植物蛋白的主要来源。为了适应现代农业发展的要求,培育优质抗逆大豆是大豆育种的发展方向之一。随着分子生物学及基因工程技术的发展,利用转基因技术将抗逆基因转入优质大豆基因组是提高其抗逆性的有效途径。Na+/H+逆向转运蛋白通过将细胞质内的Na+外排或将Na+区隔化到液泡中,来维持细胞质的Na+稳态和Na+/K+比相对稳定,从而减少盐胁迫对植株的伤害。本试验从大豆品种冀豆7号中克隆得到了耐盐基因GmNHX1,将其转入拟南芥验证其与植物耐盐的相关性;在实验室前期工作基础上进一步优化大豆胚尖再生及转化体系;并采用农杆菌介导法将GmNHX1基因转入盐敏感性大豆品种中。结果如下:1、通过RT-PCR从大豆品种冀豆7号中克隆出Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX1,经生物信息学分析表明该基因与已知功能的液泡膜Na+/H+反向转运蛋白具有较高的同源性。半定量RT-PCR分析表明GmNHX1属于组成型表达,其表达受NaCl胁迫上调。盐胁迫下叶片中GmNHX1的表达明显高于根中,耐盐品种冀豆7号中GmNHX1的本底表达水平比盐敏感性大豆品种冀豆17号低,但在盐胁迫下,冀豆7号GmNHX1的表达量较冀豆17号上调明显。初步表明GmNHX1与大豆响应盐胁迫有关。2、构建了pCAMBIA1300-35S::GmNHX1-eYFP双元表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型（columbia型）拟南芥,获得了转GmNHX1的拟南芥,经150 mM NaCl处理证明GmNHX1基因能够明显增加转基因拟南芥的耐盐性。3、在本实验室前期工作基础上对大豆胚尖再生体系进行了优化。结果表明,6-BA浓度在0.20.5 mg/L时对供试4个大豆基因型的胚尖再生效果较好,其中冀豆16的再生效果最佳;TDZ浓度在0.21.0 mg/L时对4个大豆基因型的胚尖再生效果较好,其中nf37出芽率和植株再生率最佳。4、确定了胚尖再生植株生根时Basta筛选的最适浓度为0.6 mg/L;而土培大豆苗Basta筛选的最适喷洒浓度为200 mg/L。5、利用优化的胚尖再生体系并通过农杆菌介导法将GmNHX1基因转入盐敏品种五星2号中,获得转GmNHX1基因的PCR阳性植株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 大豆GmNHX1 基因的克隆、表达及功能初探
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 酶及化学试剂
• 2.1.5 培养基及营养液配方
• 2.2 基因克隆及表达分析
• 2.2.1 材料处理及取样
• 2.2.2 RNA 提取
• 2.2.3 总RNA 浓度、纯度及完整度检测
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 引物设计
• 2.2.6 GmNHX1 的PCR 扩增
• 2.2.7 PCR 产物回收
• 2 法制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞'>2.2.8 CaC1₂法制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞
• 2.2.9 PCR 产物与克隆载体的连接和转化
• 2.2.10 阳性克隆的蓝白斑筛选
• 2.2.11 质粒提取
• 2.2.12 双酶切质粒鉴定
• 2.2.13 测序分析
• 2.2.14 生物信息学分析
• 2.3 GmNHX1 基因过表达拟南芥植株的获得及表型鉴定
• 2.3.1 双元表达载体构建
• 2.3.2 重组载体的鉴定
• 2.3.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.3.4 拟南芥的种植与转化
• 2.3.5 转基因种子的收获以及转基因苗的筛选与鉴定
• 2.3.6 过表达植株耐盐表型的验证
• 3 结果与分析
• 3.1 大豆Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆
• 3.2 大豆GmNHX1 基因编码的蛋白质特征及系统进化分析
• 3.3 大豆GmNHX1 基因对盐胁迫的应答特征
• 3.4 GmNHX1 基因过表达拟南芥植株的获得及功能鉴定
• 3.4.1 目的片段的获得
• 3.4.2 转化载体的构建
• 3.4.3 pCAMBIA1300-35S::GmNHX1-eYFP 载体的农杆菌转化
• 3.4.4 拟南芥的农杆菌转化及阳性植株的筛选和鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二章 大豆胚尖再生体系的优化及GmNHX1 的遗传转化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与处理
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 外植体材料的获得和处理
• 2.1.3 培养条件
• 2.2 转化大豆Basta 筛选条件的摸索
• 2.2.1 生根筛选
• 2.2.2 温室培养筛选
• 2.3 农杆菌介导的GmNHX1 基因的大豆遗传转化
• 2.3.1 菌株和载体
• 2.3.2 双元表达载体的构建
• 2.3.3 胚尖转化过程
• 2.3.4 大豆基因组的提取方法
• 2.3.5 GmNHX1 基因的PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 6-BA 和TDZ 对大豆胚尖再生的影响
• 3.1.1 不同浓度6-BA 和TDZ 对不同基因型大豆胚尖出芽率的影响
• 3.1.2 不同浓度6-BA 和TDZ 对不同基因型大豆胚尖平均丛生芽数的影响
• 3.1.3 不同浓度6-BA 和TDZ 对不同基因型大豆胚尖再生率的影响
• 3.2 转化大豆Basta 筛选条件的摸索
• 3.2.1 不同浓度Basta 对大豆生根率的影响
• 3.2.2 不同浓度Basta 对植株生根状况的影响
• 3.2.3 不同浓度Basta 对温室培养大豆苗的影响
• 3.3 农杆菌介导的GmNHX1 基因的大豆遗传转化
• 3.3.1 目的片段的获得
• 3.3.2 pCAMBIA3301-35S::GmNHX1 载体的构建及农杆菌转化
• 3.3.3 pCAMBIA3301-35S::GmNHX1 的大豆遗传转化
• 4 讨论
• 4.1 6-BA 和TDZ 对大豆胚尖再生的影响
• 4.2 大豆遗传转化的Basta 筛选浓度
• 4.3 大豆过表达GmNHX1 的功能探讨
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢