论文题目: MDR1的导向药物及其耐化疗药的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 赵福广
导师: 陶文沂
关键词: 原核表达,真核表达,间接,单克隆抗体,基因治疗,腺病毒表达载体,脐血,胚胎干细胞,化疗
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究将MDR 1 1kb片段克隆到原核表达载体pET-28b(+)中,构建成重组质粒pETP-gp。将pETP-gp分别转入受体菌BL21(DE3)和BL21(DE3)plyss中,在IPTG的诱导下,两转化菌均可高效表达目的基因,其中BL21(DE3)plyss较高,其表达量可高达菌体蛋白总量的48%。免疫印记表明所表达的蛋白是P-gp特异性蛋白。这是MDR 1 1kb片段首次在E.coli中得到高效表达。以E.coli高效表达的MDR 1 1kb片段的蛋白为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG为二抗,建立了检测MDR 1抗体的间接ELISA方法。确定了最佳反应条件和自行制备的兔抗人酶标抗体工作浓度。结果表明应用重组pETP-gp表达的蛋白检测MDR 1抗原具有特异性高,抗原易纯化,成本低等特点。将MDR 1和MDR 1 1kb片段分别克隆入pcDNA3中,构建了2种真核表达质粒pcDNA3/MDR 1和pcDNA3/P-gp。将2种质粒转染K562细胞,结果表明2种质粒可在体外表达MDR 1蛋白。动物试验表明2种质粒均可诱导产生MDR 1特异性免疫反应。将构建的表达质粒pcDNA3/P-gp,佐以司苯、甘油免疫小鼠,通过融合、筛选、克隆,获得了4株分泌抗MDR 1 McAb杂交瘤细胞株MdrA、MdrB、MdrC、MdrD。通过Western-blotting试验和间接ELISA法检测证明4株McAb可与pcDNA3/MDR 1、pcDNA3/P-gp和pHVaMDR 1 3种重组抗原反应。为临床检测MDR 1抗原创造有利条件。将MDR 1插入到腺病毒载体中,构建重组腺病毒质粒pHVaMDR 1。采用浓缩病毒上清转染法可有效地将外源性MDR 1导入脐血有核细胞中。该脐血有核细胞能表达P-gp,对化疗药物长春新碱、柔红霉素具有一定的耐受性。本实验分离和培养了昆明鼠胚胎干细胞。并把MDR 1导入小鼠胚胎干细胞后回输入同种小鼠体内后,受体鼠对化疗药物的耐受性有所增强,从而在动物水平证实了通过MDR 1的导入在体内保护骨髓细胞的可行性。也为解决恶性肿瘤病人在化疗中的骨髓抑制提供了可靠的试验依据。
论文目录:
中文摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 多药耐药
1.2 P-gp
1.3 多药耐药与细胞凋亡
1.4 耐药逆转和耐药相关蛋白的临床意义
1.5 本课题的目的及意义
第二章 以重组P-gp为抗原建立检测MDR 1间接ELISA方法的研究
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 方法
2.3 结果
2.3.1 重组PCR扩增P-gp基因
2.3.2 pETP-gp 的克隆及鉴定
2.3.3 pETP-gp 的诱导表达
2.3.4 兔抗人IgG 的制备
2.3.5 间接ELISA 条件的确定
2.3.6 MDR 1抗体的检测结果
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 MDR 1 真核表达载体的构建及pcDNA3/P-gp 单克隆抗体的靶向性
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 方法
3.3 结果
3.3.1 目的基因的获得
3.3.2 pcDNA3 质粒的鉴定
3.3.3 重组体的鉴定
3.3.4 重组质粒转染真核细胞表达分析
3.3.5 动物免疫试验
3.3.6 重组质粒免疫小鼠血清抗体检测结果
3.3.7 单克隆抗体的特异性鉴定结果
3.3.8 4株McAb对3种质粒的重组蛋白的检测结果
3.3.9 用McAb 检测pcDNA3/P-gp 在K562 细胞中的表达结果
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 MDR 1基因腺病毒载体的构建及鉴定
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 方法
4.3 结果
4.3.1 MDR 1的鉴定
4.3.2 重组腺病毒的鉴定
4.3.3 重组病毒滴度的检测
4.3.4 重组病毒感染靶细胞的结果
4.4 讨论
4.5 本章小结
第五章 MDR 1基因在脐血有核细胞表达及耐药性的体外研究
5.1 引言
5.2 材料及方法
5.2.1 材料
5.2.2 方法
5.3 结果
5.3.1 重组病毒滴度测定
5.3.2 MDR 1基因转染脐血单个核细胞后细胞的生长状况
5.3.3 外源性MDR 1 基因在CBNC 的整合和表达结果
5.3.4 外源性MDR 1基因转染CBNC P-gp阳性率的测定及组间比较
5.3.5 免疫组化法检测脐血单个核细胞的转染率
5.3.6 间接ELISA法测定CBNC的P-gp的表达的结果
5.3.7 转染脐血细胞周期生物学特性的检测结果
5.3.8 导入MDR 1 基因的CBNC 对长春新碱的耐受效应
5.3.9 导入MDR 1的CBNC的CFU-GM培养
5.4 讨论
5.5 本章小结
第六章 MDR 1基因转染鼠胚胎干细胞在化疗中药物耐受量的研究
6.1 引言
6.2 材料与方法
6.2.1 材料
6.2.2 方法
6.3 结果
6.3.1 ES 细胞分离培养过程
6.3.2 ES 细胞的生长状态
6.3.3 ES 细胞AKP 组织化学染色
6.3.4 ES 细胞Oct-4 表达
6.3.5 ES 细胞的核型分析
6.3.6 动物试验
6.3.7 MDR 1基因的检测
6.4 讨论
6.5 小结
第七章 结论
参考文献
附图
致谢
论文创新点
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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