茶树种子在低温贮藏过程中差异基因表达的研究

论文摘要

中国是茶树的起源地,种质资源极其丰富,但由于自然和人为的众多因素,茶树种质资源的流失由来已久。所以为长期保存茶树的遗传信息,保护茶树种质资源,寻找可长期保存茶树种质资源的途径就非常重要。成熟茶树种子含水率在35～40%左右,一般认为属顽拗型种子,在保存上存在较大的困难。传统的贮藏方法是沙藏,即保存在一定湿度、温度和通气条件的环境中,但随着贮藏时间的延长,发芽率迅速下降,半年后只有20%左右。目前种质保存的最主要方式是在低温种质库中保存,但种质在低温库中的保存也存在种子老化等问题。且茶树种子不耐低温,低温贮藏时种子的活性一般只能维持几个月的时间,从保存种质资源角度来看,远远不能达到要求。到目前为止,对顽拗型种子的研究主要集中在贮藏条件与种子发芽力的关系以及低温贮藏过程中生理、生化和细胞学研究上,在分子水平上对顽拗型种子不耐低温的本质研究得较少。为此本实验采用cDNA-AFLP技术,以茶树无性系龙井43种子为实验材料,进行如下研究:（1）茶树种子临界含水量的测定（2）茶树种子低温贮藏过程中差异表达基因研究①利用cDNA-AFLP方法,研究同一品种茶树种子低温诱导后基因表达差异。②对差异条带克隆测序后,以RT-PCR技术对差异表达基因进行鉴定。③用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆对其全长cDNA序列和序列分析。结果获得8条差异片段,通过NCBI进行BLAST比对发现,发现有6条基因与已知功能基因相关。这些差异表达的片段序列可分为6类分别是:金属蛋白FtsH（TDF1）,老化蛋白（TDF2）,蛋白激酶（TDF3）,人类表皮生长因子（TDF4）,核酸和蛋白转录调控因子（TDF5）,水稻编码假设蛋白（TDF6）。其中差异表达片段TDF1、TDF2在茶树种子低温贮藏过程中未见报道。利用RACE技术得到了TDF1和TDF2cDNA全长,全长分别为709bp和917bp。其中TDF1与金属蛋白FtsH蛋白同源性较高,TDF2与拟南芥老化蛋白有很高的同源性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 种子低温贮藏的国内外研究进展
• 1.2 cDNA-AFLP技术及其在基因差异表达分析中的应用
• 1.2.1 cDNA-AFLP技术国内外研究的进展
• 1.2.2 cDNA-AFLP技术的基本原理和实验流程
• 1.2.3 cDNA-AFLP的技术特点
• 1.3 cDNA-AFLP在分离特异表达基因中的应用
• 2 引言
• 2.1 研究意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 研究技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 试剂与仪器
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 生化试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 茶树种子临界含水量的测定
• 3.3.2 茶树种胚中总RNA的提取与检测
• 3.3.3 双链cDNA的合成
• 3.3.4 cDNA-AFLP差异分析
• 3.3.5 差异片段TDF1和TDF2全长cDNA的克隆
• 4 结果与分析
• 4.1 茶树种子临界含水量的测定
• 4.2 茶树种子在低温贮藏过程中差异基因表达的研究
• 4.2.1 茶树种子总RNA的提取鉴定
• 4.2.2 cDNA的合成
• 4.2.3 cDNA-AFLP聚丙烯酰胺变性胶电泳结果
• 4.2.4 差异片段的回收和二次扩增以及克隆测序
• 4.2.5 差异片段的测序结果与序列同源性分析
• 4.3 差异片段TDF1和TDF2基因全长cDNA的克隆
• 4.3.1 两个基因片段的3'RACE扩增
• 4.3.2 两个基因片段的5'RACE扩增
• 4.3.3 基因全长序列的扩增
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文