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dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究

2020-12-03阅读(662)

dsRNA介导的沉默抑制子抗马铃薯Y病毒病的研究

论文摘要

本研究首先对采自安徽不同地区的感染马铃薯Y病毒（PVY）的烟草和马铃薯病样进行病毒株系的分子鉴定。再利用dsRNA技术,构建HC-Pro基因部分片段反向重复载体转化烟草,沉默外源侵染寄主的PVY沉默抑制子HC-Pro基因,在RNA水平上将HC-Pro基因的mRNA降解,使其不能表达发挥作用,从而提高转基因烟草的抗病毒RNA沉默效率。HC-Pro反向重复表达载体以农杆菌介导转化烟草,以获得能够稳定遗传的高抗或免疫PVY的转基因烟草。1.来自安徽不同寄主PVY分离物的血清学鉴定及其CP基因分子进化分析采集安徽不同地区感染马铃薯Y病毒（PVY）的烟草、马铃薯和番茄病样,部分病样的ELISA检测结果呈阳性。RT-PCR克隆4号样和7号样PVY的CP基因并测序。结果表明,来自烟草PVY的CP基因（PVY-CP-4）和来自马铃薯PVY的CP基因（PVY-CP-7）序列全长均为801 nts,编码267个氨基酸。构建PVY CP基因系统关系树及进行序列相似性比较,PVY-CP-4与PVYO、PVYN:O聚成一个分支,且与PVYO（EF026074）的序列相似性最高,达99.4%,说明来源于安徽合肥烟草上的PVY应该属于PVYO株系;而PVY-CP-7与PVYN、PVYNTN聚成另一分支,且与PVYNTN（AJ890347）、PVYNTN（EF026075）和PVYNTN（AJ585342）的序列相似性最高,达98.3%,推测来源于安徽五河马铃薯上的PVY-CP-7可能属于PVYNTN株系。2.侵染烟草的马铃薯Y病毒（PVY）HC-Pro基因的克隆及序列分析根据ELISA的检测结果,选择阳性反应强烈的4号样（烟草）,RT-PCR克隆PVY HC—Pro基因并测序。结果表明,来自烟草PVY的HC-Pro基因（HC-Pro-4）全长1359 bp,编码453个氨基酸,与PVYN（AM268435）HC-Pro基因的核苷酸序列相似性最高,达99.0%。构建PVY HC-Pro-4与其它14个PVYHC-Pro基因的系统关系树,可以看出PVY HC-Pro-4与PVYN（AM268435）的亲缘关系最近。HC-Pro基因的克隆为进一步研究抗病毒基因工程奠定了基础。3.马铃薯Y病毒部分辅助成分蛋白基因的反向重复植物表达载体构建根据PVY HC-Pro-4（AM905427）的核苷酸序列设计特异性引物,分别克隆正反向ΔHC-Pro基因片段。先将反向片段ΔHC-Pro（i）插入含内含子的载体pSK-In,获得中间载体pSK-In-ΔHC-Pro（i）。再将In-ΔHC-Pro（i）从pSK上切下,插入表达载体pBI121上,获得重组质柆pBI-In-ΔHC-Pro（i）。最后将正向片段ΔHC-Pro（r）插入pBI-In-ΔHC-Pro（i）,得到含ΔHC-Pro反向重复的植物表达载体pBI-ΔHC-Pro（r）-In-ΔHC-Pro（i）。4.反向重复表达载体以农杆菌介导转化烟草利用三亲交配法将反向重复表达载体pBI-ΔHC-Pro（r）-In-ΔHC-Pro（i）导入农杆菌EHA105菌株中,采用叶盘法分别转化本氏烟和普通烟品种云烟85。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 文献综述
  • 1 马铃薯Y病毒（PVY）的研究现状
  • 1.1 马铃薯Y病毒的生物学特性
  • 1.2 PVY株系的分类研究
  • 1.3 马铃挤Y病毒属病毒基因组的结构及功能
  • 1.4 马铃薯Y病毒病的防治
  • 2 RNA沉默与植物抗病毒特性
  • 2.1 RAN沉默在生物界存在的普遍性
  • 2.2 RNA沉默的机制
  • 2.3 构建反向重复产生dsRNA可以介导高效基因沉默
  • 3 RNA沉默是植物自然的抗病毒机制
  • 4 RNA沉默的病毒抑制子
  • 4.1 RNA沉默的病毒抑制子种类
  • 4.2 RNA沉默抑制子抑制基因沉默的机制
  • 4.2.1 马铃薯Y属病毒（Potyvirus）HC-Pro
  • 4.2.2 黄瓜花叶病毒（CMV）2b
  • 4.2.3 马铃薯X病毒（PVX）P25
  • 4.3 RNA沉默病毒抑制子的应用前景
  • 引言
  • 材料与方法
  • 1 供试材料
  • 1.1 病样采集
  • 1.2 植物材料
  • 1.3 菌种和载体
  • 1.4 酶和化学试剂
  • 1.5 常用缓冲溶液和培养基
  • 1.6 抗生素
  • 1.7 仪器设备
  • 2 试验方法
  • 2.1 植物病毒的ELISA检测
  • 2.2 DNA分子操作常用方法
  • 2.2.1 叶片总RNA的提取
  • 2.2.2 cDNA的合成
  • 2.2.3 PCR技术
  • 2.2.4 RT-PCR扩增技术
  • 2.2.5 Nested-PCR扩增技术
  • 2.2.6 Overlap Extension PCR扩增
  • 2.3 PCR产物的克隆和序列分析
  • 2.3.1 PCR产物的回收和纯化
  • 2.3.2 PCR产物的连接
  • 2.3.3 感受态细胞的制备
  • 2.3.4 连接产物的转化
  • 2.3.5 重组质粒的筛选
  • 2.3.6 重组质粒的鉴定
  • 2.3.7 克隆基因的序列测定、分析和登录
  • 2.4 外壳蛋白（CP）基因的获得
  • 2.4.1 外壳蛋白（CP）基因的引物设计与合成
  • 2.4.2 cDNA合成及外壳蛋白（CP）基因的RT-PCR扩增
  • 2.5 HC-Pro基因的获得
  • 2.5.1 HC-Pro基因的引物设计与合成
  • 2.5.2 HC-Pro的Nested-PCR扩增
  • 2.6 反向重复植物表达载体的构建
  • 2.6.1 △HC-Pro片段的获得
  • 2.6.2 △HC-Por反向重复植物表达载体的构建
  • 2.7 反向重复植物表达载体导入农杆菌（三亲交配法）
  • 2.8 烟草转化及卡那霉素抗性植株的再生
  • 结果与分析
  • 1 病毒的ELISA检测结果
  • 2 外壳蛋白（CP）基因的获得
  • 2.1 CP基因的RT-PCR扩增
  • 2.2 CP基因的克隆和序列分析
  • 3 HC-Pro基因的获得
  • 3.1 HC-Pro的PCR扩增
  • 3.2 HC-Pro的克隆和序列分析
  • 4 反向重复植物表达载体的构建
  • 4.1 △HC-Pro片段的获得
  • 4.2 △HC-Pro反向重复植物表达载体的构建
  • 4.3 烟草的转化和卡那抗性植株的获得
  • 讨论
  • 1 马铃薯Y病毒的外壳蛋白（CP）基因
  • 2 PVY HC-Pro基因
  • 3 内含子的使用和选择
  • 4 反向重复植物表达载体构建策略
  • 5 dsRNA介导的抗性的应用
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录A
  • 附录B
  • 附录C
  • 附录D
  • 致谢
  • 作者简介
  • 在读期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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