海岛棉再生体系的建立及遗传转化

论文摘要

近年来，棉花的体细胞组织培养己经有了较大的发展，但是大多集中在少数品种上，尤其是一些模式品种，而且仍然存在着许多尚未解决的问题，如胚状体萌发率偏低、畸形苗率较高、再生周期长等问题。所以，不断发展新的再生体系和拓宽棉花再生植株的品种数量是目前棉花组织培养的趋势。基因工程和分子生物学的发展促使转基因技术广泛地应用于棉花育种，使棉花育种能够实现分子设计，将外源有益基因导入棉花细胞，并使其定向而稳定地遗传。建立高效而稳定的棉花遗传转化体系，是保证棉花转基因获得大量可供筛选群体的前提条件。因此，建立高效的棉花体细胞胚胎发生和植株再生体系，对于棉花基因工程，功能基因组和现代棉花育种具有重要的意义。本研究以新疆海岛棉和陆地棉作为实验材料，着重从海岛棉体细胞胚发生和器官发生再生植株途径的角度考虑，进行下胚轴愈伤诱导和茎尖培养植株再生的研究，探讨海岛棉体细胞胚发生和茎尖再生，以及农杆菌介导遗传转化的主要影响因素。1．以海岛棉品种为实验材料，采用下胚轴、子叶、和根作为外植体诱导愈伤，通过对多种激素及其配比、碳源、无机盐、氨基酸等对愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导和分化效应进行了研究，结果表明，0.1-1.0mg／L NAA+0.1-1.0mg／L KT这一激素配比最适合诱导海岛棉愈伤组织；继代时间的长短影响了胚胎的发生，长期继代使愈伤组织疯长程度加强，抑制了细胞的分化。2．以海岛棉和陆地棉品种为实验材料，采用茎尖作外植体，6-BA来启动和诱导丛生芽的发生，丛生芽数可以达到12个。3．以海岛棉和陆地棉品种为实验材料，采用茎尖作为外植体，通过农杆菌介导的转基因技术，辅助以超声波，将IPT基因导入海岛棉和陆地棉基因组，又通过添加6-BA，诱导丛生芽。超声波在50w-100w，处理时间1-3min对转化的辅助效果最好。在选择培养基上进行Km抗性试验，得到了具有抗性的丛生芽并得到转基因植株。4．本研究共转化了3000多个茎尖，通过PCR检测，阳性植株有2.97％。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1.文献综述
• 1.1 棉花组织培养与植株再生研究进展
• 1.1.1 体细胞培养与植株再生
• 1.1.2 花药培养
• 1.1.3 茎尖培养
• 1.1.4 胚珠和胚培养
• 1.1.5 原生质体培养
• 1.1.6 存在问题与发展趋势
• 1.2 棉花体细胞胚再生植株的研究进展
• 1.2.1 能分化出体细胞胚胎的愈伤组织状态
• 1.2.2 难分化出体细胞胚胎的愈伤组织状态
• 1.2.3 外植体对棉花体胚发生和植株再生的影响
• 1.2.4 培养基对棉花体胚发生和植株再生的影响
• 1.3 植物转基因技术的研究进展及其应用
• 1.3.1 植物转基因技术
• 1.3.2 植物转基因方法
• 1.4 转基因植物的鉴定方法
• 1.4.1 标记基因的选择
• 1.4.2 分子检测
• 1.5 棉花转基因研究与应用
• 1.5.1 抗虫基因的分离与抗虫棉花的获得
• 1.5.2 抗除草剂基因工程棉花
• 1.5.3 抗病转基因棉花
• 1.5.4 抗逆及品质改良转基因棉花
• 1.5.5 改良生产品质
• 1.5.6 抗虫杂交棉的培育
• 2 研究目的与意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 棉花材料
• 3.1.2 根癌农杆菌和转化载体
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 常用的储备液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 海岛棉再生体系的建立
• 3.2.2 农杆菌的介导的遗传转化
• 3.2.3 转化植株的分子鉴定
• 3.2.4 数据处理
• 4 结果分析
• 4.1 海岛棉再生体系的建立
• 4.1.1 外植体对棉花体细胞胚胎发生和植株再生的影响
• 4.1.2 不同激素组合对棉花出愈率和出根率以及生长状态的影响
• 4.1.3 继代时间对愈伤分化的影响
• 4.1.4 愈伤组织形态、生长状态与细胞形态的关系
• 4.1.5 不同激素对丛生芽诱导的影响
• 4.2 根癌农杆菌介导的棉花遗传转化
• 4.2.1 外植体的生理状况对转化的影响
• 4.2.2 茎尖分生组织制备取材时间对出芽率和转化率的影响
• 4.2.3 超声波辅助处理对遗传转化的影响
• 4.2.4 农杆菌活力,侵染时间对转化的影响
• 4.2.5 共培养时间对转化率的影响
• 4.3 转化体的筛选与抗性植株的获得
• 4.4 转基因植株的PCR检测
• 5 讨论
• 5.1 海岛棉愈伤诱导体系的优化
• 5.2 丛生芽诱导的条件优化
• 5.2.1 无菌苗的培养条件
• 5.2.2 6-BA在棉花茎尖培养中的作用
• 5.3 受体材料的选择与遗传转化的方法
• 5.4 创伤方式与辅助处理对转化的影响
• 5.5 通过卡那霉素筛选阳性幼苗
• 6 文献
• 致谢