鱼腥草MVD基因cDNA克隆及挥发油分析

论文摘要

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物（Houttuynia cordata Thunb）,是一种酚类和多糖物质含量很高的草本植物,由于多糖的干扰,其RNA提取比较困难。甲羟戊酸（MVA）途径存在于植物质体中,该途径的产物异物烯基焦磷酸（IPP）是挥发性油合成的重要前体物质。甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（MVD）直接催化MVA途经中由MVAPP生成重要前体IPP的反应,是MVA途经中的一个关键酶。本文以湘白鱼腥草为材料,对鱼腥草从以下几个方面进行了研究:（1）为筛选出适合鱼腥草叶片RNA提取的方法,以鱼腥草叶片为材料,比较了经典RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒A、Trizol试剂盒B以及富含多糖类材料RNA提取试剂盒的效果。结果表明Trizol试剂盒和经典RNA提取试剂盒难以提取出高质量的RNA,说明普通RNA提取试剂盒难以提取出高效的鱼腥草叶片总RNA。而富含多糖类材料RNA提取试剂盒提取的RNA质量高,完整性好,可以满足进一步分子生物学研究的要求。（2）本文利用NCBI,GENEDOC.EXE,Primer Premier 5.0等数据库和软件设计简并性引物进行RT-PCR,从鱼腥草中克隆到1个长度为514bp的cDNA片段,再分别采用3’RACE方法和GenomeWalker方法扩增出MVD基因cDNA的3’和5’末端。鱼腥草MVD基因cDNA包括1266bp的开放阅读框,编码421个氨基酸,该序列已经提交到GenBank数据库,登录号为JF430481。（3）采用荧光定量PCR研究了MVD基因在根、茎、叶、花四个部位中的表达情况,结果显示在根中的表达量很高,在茎、叶和花中表达量都很低。采用水蒸气蒸馏提取鱼腥草挥发性油,鱼腥草根、茎、叶、花四个部位挥发性油含量为花>根>叶>茎。采用气相色谱质谱联用仪对挥发性油组分进行鉴定,根、茎、叶和花四部位共鉴定出35种化合物,其中共有化合物24种,各部位挥发性油组分基本一致;采用峰面积归一化法测定各组分含量,含量存在较大差异,甲基正壬酮含量最高;结合主成分分析、马氏距离和相似度评价等方法探求各部位之间的异同。结果表明,茎和叶之间的差异小,花和根、茎、叶差异明显,根和其它三个部位差异大。挥发性油成分含量和MVD基因表达之间存在一定相关性,但不同的成分与MVD基因表达的相关性差异较大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 鱼腥草的性状特征及其分布情况
• 1.1.1 鱼腥草的性状特征
• 1.1.2 鱼腥草的分布区域与生长环境
• 1.2 鱼腥草挥发性油研究
• 1.3 鱼腥草挥发性油的药理作用及临床应用
• 1.3.1 药理研究
• 1.3.2 临床应用
• 1.4 鱼腥草分子生物学研究
• 1.5 基因克隆技术
• 1.5.1 序列克隆
• 1.5.2 功能克隆
• 1.5.3 定位克隆
• 1.5.4 表型克隆
• 1.5.5 RACE 技术
• 1.5.6 GenomeWalker 方法
• 1.6 本论文主要研究内容和意义
• 1.6.1 研究背景
• 1.6.2 研究目的与意义
• 第2章 鱼腥草叶片RNA 提取方法研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同方法提取RNA 的质量浓度和纯度测定
• 2.3.2 不同方法提取RNA 的电泳分析
• 2.3.3 RT-PCR 分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 鱼腥草甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（MVD）克隆
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 鱼腥草MVD 基因cDNA 3’端的获得
• 3.3.1 引物设计
• 3.3.2 RNA 提取
• 3.3.3 反转录反应
• 3.3.4 巢式PCR
• 3.3.5 扩增片段回收与克隆
• 3.4 鱼腥草MVD 基因cDNA 5’端的获得
• 3.4.1 引物设计
• 3.4.2 RNA 提取
• 3.4.3 反转录反应
• 3.4.4 cDNA 第二链合成与粘性末端补平
• 3.4.5 加接头
• 3.4.6 巢式PCR
• 3.4.7 扩增片段回收与克隆
• 3.5 实验结果与分析
• 3.5.1 鱼腥草MVD 基因特异片段的PCR 扩增与克隆
• 3.5.2 鱼腥草MVD 基因cDNA3’端的获得
• 3.5.3 鱼腥草MVD 基因cDNA5’端的获得
• 3.5.4 鱼腥草MVD 基因cDNA 全长拼接
• 3.5.5 鱼腥草MVD 蛋白质预测分析
• 3.5.6 蛋白质跨膜分析
• 3.5.7 蛋白结构信号肽预测
• 3.5.8 蛋白质二级结构分析
• 3.5.9 鱼腥草MVD 氨基酸序列同源性比较及其系统发育树构建
• 3.5.10 蛋白质三级结构分析
• 3.6 本章小结
• 第四章 鱼腥草不同部位MVD 基因的表达与挥发性油分析研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 MVD 基因表达的组织特异性
• 4.3.2 不同部位挥发性油含量
• 4.3.3 不同部位挥发性油主成分分析
• 4.3.4 马氏距离与相似度分析
• 4.3.5 挥发性油组分含量分析
• 4.3.6 MVD 基因的表达与挥发性油成分的相关性分析
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 附录 B 培养基及溶液配方
• 致谢