小麦全长cDNA文库构建、测序与分析

论文摘要

作物基因组学是当今最重要的研究领域。小麦是世界上最重要的粮食作物之一,但普通小麦（T.aestivum）为异源六倍体（AABBDD）,基因组庞大(1.6×1010bp),重复序列多（约90%）,目前还难以通过全基因组测序进行小麦功能基因组研究。全长cDNA克隆不仅包含完整的阅读框,还拥有5′和3′端的非编码区,是进行高通量的功能基因组学研究的一条有效途径。 在引进、消化吸收的基础上,我们对Cap-trapper法做了进一步的改进,形成了一套简单易行的技术体系,建立了我们自己的全长cDNA文库构建技术平台。利用改进的Cap-trapper法,分别构建了不同倍性、不同组织、不同处理的小麦全长cDNA文库10个,涉及普通小麦（AABBDD）及其三个二倍体祖先种（AA、SS和DD）和四倍体波斯小麦（AABB）共计小麦的5个种,涉及幼苗、根、愈伤组织、花药、胚乳,并设有白粉菌诱导诱导与对照等。所建文库插入片段平均为1.5kb左右,原始文库的库容量在6.0×105～5.0×106pfu之间,经后期测序并与GenBank公布的小麦全长mRNA序列比对分析表明克隆的全长比例为93%左右,扩增文库滴度在1010pfu/ml数量级,适合于大规模测序需要,是开展小麦功能基因学研究的宝贵资源。 试验从10个全长cDNA文库随机挑取大约11万个克隆进行3’端测序,获得106,671条3’端EST,去除冗余后选择代表性克隆进行了克隆5’端测序,获得31,732条5’EST,共获得138,403条EST,得到高质量序列（Q20）数据7.46×107bp。在去除ployA和短于100bp的序列后获得5’EST和3’EST分别为30,586条和95,736条。经cap3软件聚类分析表明试验获得了32,899条不重复克隆。 GC含量统计表明小麦族基因cDNA序列中GC含量为54.0%,这与水稻基因组GC含量基本一致（53.4%）,而与拟南芥有明显差别（40.7%）;5’和3’EST比较发现5’端GC含量为57.80%,明显高于3’的GC含量（52.8%）。推测小麦基因的这种高GC含量特别是5’端高GC含量是小麦全长基因克隆和测序困难的原因之一。 将获得的32,899条不重复序列使用blast软件将比对参数E值设为le-20对879,695条小麦公共EST数据进行相似性搜索,结果表明8,800条为新的小麦EST（26,75%）;使用参数1e-5对水稻32,127条全长cDNA序列比对结果表明15,992条（48.6%）序列在水稻全长cDNA中没有对应序列。同时,利用1e-20的参数对水稻1,191,102条水稻EST数据blast结果表明18,672条没有相应序列（56.75%）;用该数据集对华大基因组研究所测序的水稻基因组序列blastn搜索结果表明14,382条（43.72%）在水稻基因组序列中没有对应序列（E-value 1e-5）。 密码子使用的偏爱性是生物在长期进化过程中逐渐形成的,影响偏爱性的因素有多种,如G+C含量,基因表达水平,基因的长度,tRNA的丰度等等。我们随机挑取了750条全长序列使用codonW软件对小麦密码子使用偏爱性进行了分析,统计结果表明小麦基因密码子第三位GC含量为54%左右,与表达基因的整体GC含量一致;同时发现小麦优先使用的密码子27个,所有优先使用的密码子均以G或者C结尾,无一例外,这与水稻的情况非常一致;而拟南芥为低GC含量物种,仅为44%,所有优先使用的密码子均以A或者T结尾。说明植物进化过程中单双子叶植物分开后首先GC含量趋异非常明显,进而密码子优先使用特性也完全不同。 使用基于Linux平台的本地化分析平台系统对获得32,899条序列进行了分子功能、生物过程和细胞组分三个层次的Gene Ontology注释,获得了小麦基因的多层次注释信息。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.植物功能基因组学研究进展
• 1.1 基因组学的概念
• 1.2 植物功能基因组学概述
• 1.3 植物功能基因组学主要研究内容
• 1.4 植物功能基因组学研究现状与发展趋势
• 1.5 植物功能基因组学研究技术与方法
• 1.6 小麦基因组学研究现状
• 2.EST技术研究进展
• 2.1 EST的概念
• 2.2 EST的应用
• 2.2.1 用于基因表达分析和新基因的发掘
• 2.2.2 基因组作图
• 2.2.3 基因表达差异的研究
• 2.2.4 用于制备DNA芯片
• 2.2.5 寻找其它序列特征
• 2.3 重要农作物EST研究进展
• 3 全长cDNA与全长cDNA文库的构建
• 3.1 普通cDNA文库
• 3.2 差减文库
• 3.2.1 差减文库的原理
• 3.2.2 差减cDNA文库的构建方法
• 3.3 均一化cDNA文库
• 3.4 全长cDNA文库
• 3.4.1 全长cDNA文库的特点
• 3.4.2 构建全长cDNA文库的方法及原理
• 3.4.3 重要生物全长cDNA克隆与测序研究进展
• 4 生物信息学研究进展
• 4.1 生物信息学产生背景
• 4.2 生物信息学概念
• 4.3 生物信息学研究内容
• 4.4 生物信息学的应用
• 4.4.1 序列对比
• 4.4.2 新基因的发现和鉴定
• 4.4.3 基因组序列信息的提取和分析
• 4.4.4 蛋白质结构和功能的预测
• 4.4.5 分子进化研究
• 4.4.6 利用生物信息学软件寻找候选分子标记
• 4.4.7 电子拼接
• 5 密码子使用偏爱性研究进展
• 6 普通小麦的分类、起源与多倍体特性
• 6.1 小麦的分类
• 6.2 普通小麦的基因组起源
• 6.3 小麦基因组起源研究方法
• 6.4 小麦基因组起源研究的对象
• 6.5 小麦的多倍体特性
• 7 实验设计
• 7.1 立项背景
• 7.1.1 小麦的起源与演化
• 7.1.2 大批量全长cDNA克隆是功能基因组学研究的重要战略资源
• 7.2 研究目的与实验内容
• 7.3 技术路线
• 第二章 小麦全长cDNA文库构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 文库构建所用的小麦材料
• 1.1.2 化学试剂、酶类以及试剂盒
• 1.1.3 引物
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总RNA提取
• 1.2.2 mRNA分离纯化
• 1.2.3 第一链cDNA合成
• 1.2.4 生物素标记
• 1.2.5 全长cDNA的捕获
• 1.2.6 末端转移酶加poly（G）
• 1.2.7 第二链合成
• 1.2.8 BsaⅠ酶切
• 1.2.9 cDNA纯化与分级
• 1.2.10 连接
• 1.2.11 包装
• 1.2.12 原始文库滴度检测
• 1.2.13 原始文库的扩增
• 1.2.14 噬粒环化
• 1.2.15 cDNA文库的单克隆保存
• 1.2.16 质粒文库的复制
• 1.2.17 质粒提取（96孔培养板）
• 1.2.18 测序
• 1.2.19 全长cDNA判别
• 2 结果分析
• 2.1 全长cDNA文库构建结果
• 2.1.1 总RNA提取及mRNA的分离纯化
• 2.1.2 cDNA文库滴度检测及库容量计算
• 2.1.3 插入片段检测
• 2.1.4 扩增文库的滴度检测
• 2.1.5 ABI 3730 XL DNA Analyzer测序体系确定
• 3 讨论
• 3.1 mRNA质量是构建高质量全长cDNA文库的基础
• 3.2 关于全长库构建方法的选择
• 3.3 对Cap-Trapper法的改良
• 1) 关于反转录引物选择
• 2) 关于全长cDNA定向克隆问题
• 3) 关于克隆插入方向问题
• 4) 关于文库构建流程简化问题
• 5) 关于构建过程中同位素示踪问题
• 6) 关于蓝白斑选择问题
• 本章结论
• 第三章 小麦全长cDNA克隆大规模测序和序列的初步分析
• 3.1 概述
• 3.1.1 本研究整体思路
• 3.1.2 研究目标
• 3.1.3 研究工作流程
• 3.1.4 本地化生物信息分析平台构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 全长cDNA文库大规模测序
• 3.2.2 cDNA文库全长比例分析
• 3.2.3 大批量测序数据预处理
• 3.2.4 基于大规模全长cDNA序列的小麦基因GC含量分析
• 3.2.5 小麦基因密码子使用偏性分析
• 3.2.6 克隆的小麦全长cDNA中新基因的确定
• 3.2.7 小麦EST数据的GO注释
• 3.2.8 粗山羊草叶和根中差异表达基因分析
• 3.2.9 中国春可育花药与败育花药基因表达差异分析
• 3.2.10 不同倍性小麦基因表达特性
• 4.讨论
• 4.1 关于重要物种全长cDNA克隆测序项目研究进展
• 4.2 关于本研究中全长cDNA文库和全长cDNA序列的应用
• 4.3 关于大批量EST数据的预处理问题
• 4.4 关于大规模EST数据的聚类拼接问题
• 4.5 关于全长cDNA序列的批量注释与功能分类
• 4.6 关于从大批量全长cDNA文库中挖掘差异表达基因
• 4.7 关于物种GC含量与最优密码子使用特性的分析
• 4.8 关于作为多倍体典型的小麦中基因表达情况
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介