胸膜肺炎放线杆菌生物被膜突变体的筛选与生物学特性的研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。APP是猪呼吸道的专性寄生菌,通过空气和直接接触来传播。由于APP血清型众多,各血清型之间交叉保护力较低,传统的灭活疫苗和亚单位疫苗的效果均不理想。因此,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。毒力因子的全面鉴定是病原菌致病机理研究和防治产品开发的基础。信号标签诱变（signature-tagged mutagenesis,STM）是一种经过优化的经典的转座子突变技术,可以用含多个序列标签的转座子构建病原菌的突变体库,通过宿主或实验动物来负向筛选致弱突变体,进而鉴定相关基因。自1995年首次建立以来,STM技术被广泛用于多种病原菌毒力相关基因的发掘与鉴定。很多病原菌为了适应体内外的环境会形成生物被膜（biofilm）。大量的研究表明,生物被膜的形成与病原菌的免疫逃避和抗药性有关,是影响感染的重要因素。本研究构建了APP血清1型的STM突变体库,从中筛选到2个生物被膜形成突变菌株,对突变基因进行了定位和克隆,对突变菌株的生物学特性进行了研究,为阐明APP生物被膜的形成机制提供了一定的试验数据。1.APP血清1型STM突变体库的构建以APP血清1型萘啶酸抗性菌株4074-N为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒（pLOF/TAG1-48）的E.coli CC118λpir或Sm17-1λpir为供体菌,在或不在E.coli DH5α（pRK2073）的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过转座子内携带的卡那霉素抗性筛选、氨苄青霉素负筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株。在APP与E.coli接合实验中,通过对两亲本接合与三亲本接合进行了比较,证明了两亲本接合的效率明显高于三亲本接合。用两亲本接合方法,构建了32个STM标签的APP突变体库,共得到1652个转座突变菌株（每个标签不少于50个突变体）。2.APP生物被膜形成突变体的筛选及插入失活基因的鉴定用96孔板法和试管法从上述APP血清1型4074-N株（不产生生物被膜）STM突变体库中筛选到两株能产生很强生物被膜的突变体,即STM1-21和STM6-42。提取突变体的基因组用转座子内的SspI酶切后进行自连接。以连接产物为模板,用转座子上的特异性引物STM10/11和STM10/12,通过反向PCR扩增,获得转座子插入位点两侧的基因片段。经DNA测序和BLAST分析,发现这两株突变体均为Mini-Tn10转座子插入失活编码一种类组氨酸核结构蛋白（Histone-like nucleoidstructuring protein）的hns基因造成的。PCR和Southern杂交进一步确定了插入突变体的正确性。3.APP H-NS的结构与功能的初步研究APP的hns基因编码一种135个氨基酸的类核结构蛋白H-NS,主要由三个结构域组成,即N端的聚合结构域、C端的DNA结合结构域和中间的柔性连接片段。通过N端的聚合结构域形成多聚体结构,C端的DNA结合结构域与靶基因结合而发挥调控作用。为了研究APP的hns基因的功能,将4074-N株的hns基因表达盒（包括其编码区、启动子和终止子序列）克隆到能穿梭质粒pJN105中,构建了一个重组表达质粒pJN-hns,分别电转化到hns转座突变菌株STM1-21（M）和亲本菌株4074-N（P）中,期望获得互补菌株（C-3）和过表达菌株（0-2）;然后比较分析了上述四个菌株P、M、C-3和O-2的生长特性、生物被膜形成和毒力的变化,结果表明:4个菌株的体外生长速度未见明显差异;除突变菌株M外,其它3个菌株均不能形成可测的生物被膜;菌株M、C-3和O-2对小鼠的毒力和溶血活性均有不同程度的减弱。互补菌株和过表达菌株的上述表型均与预期的结果不一致。为了进一步解释这种现象,我们通过实时荧光定量RT-PCR分析了上述4个菌株中hns基因及两种重要毒力基因axpⅠA和axpⅡA的表达情况。结果显示,hns基因在C-3和O-2菌株中均有表达,但表达量均比亲本菌株P还要低,提示H-NS的缺失在C-3株中并没有得到有效互补,H-NS也没有在O-2株中过表达,C-3和O-2均表现为hns的下调表达菌株,这可能是因为hns基因的表达存在自调控机制,这种表达自调控机制在大肠杆菌中已有报道。此外,axpⅠA和axpⅡA的表达下调也初步解释了菌株M、C-3和O-2的毒力与溶血活性减弱现象。为了进一步研究H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响,本实验以APP血清1型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408 bp的hns基因编码区,克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）,经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19 kD的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/L的rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低,而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应。可见,H-NS作为一种DNA结合蛋白,不仅可以调控其它重要基因的表达,其自身的表达也受到严格的调控。它所调控的靶基因及自身调控机制有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（ABBREVIATION）表
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎及其危害
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎流行现状
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的传播途径
• 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的危害
• 1.2 猪传染性胸膜肺炎病原学
• 1.2.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现
• 1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌的基本特征
• 1.2.3 胸膜肺炎放线杆菌的血清型
• 1.2.4 胸膜肺炎放线杆菌致病机理
• 1.2.5 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子
• 1.3 信号标签诱变（STM）技术
• 1.3.1 STM技术的原理
• 1.3.2 STM技术的应用
• 1.4 生物被膜
• 1.4.1 生物被膜的定义
• 1.4.2 生物被膜的结构
• 1.4.3 生物被膜的形成机制
• 1.4.4 生物被膜与毒力的关系
• 1.4.5 生物被膜在胸膜肺炎放线杆菌中的研究
• 1.5 DNA结合蛋白—H-NS蛋白
• 1.5.1 Histone-like蛋白家族
• 1.5.2 H-NS蛋白的结构
• 1.5.3 H-NS与DNA间的相互作用
• 1.5.4 H-NS蛋白质之间的相互作用
• 1.5.5 hns基因的调节系统
• 2 胸膜肺炎放线杆菌1型STM突变体库的构建
• 2.1 研究目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与质粒
• 2.2.2 培养基及抗生素的配制
• 2.2.3 主要试剂及其配制
• 2.2.4 主要仪器设备
• 2.2.5 寡聚核苷酸引物
• 2.2.6 菌种活化与培养
• 2.2.7 胸膜肺炎放线杆菌的鉴定
• 2.2.8 胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性的诱导
• 2.2.9 质粒pLOF/Km Tag1-48的增殖及保存
• 2.2.10 细菌的接合转移（mating）
• 2.2.11 突变株的筛选与鉴定
• 2.2.12 Southern blot
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 胸膜肺炎放线杆菌血清1型和血清3型的PCR鉴定
• 2.3.2 萘啶酸抗性的诱导
• 2.3.3 Mating中二亲本与三亲本接合方法的比较
• 2.3.4 不同血清型的APP菌株接合及转座效率的比较
• 2.3.5 STM突变体库的构建
• 2.3.6 突变株的筛选与鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于萘啶酸抗性菌株的获得
• 2.4.2 关于接合转移mating
• 2.4.3 关于STM突变株的鉴定
• 3 生物被膜形成突变体的筛选及插入失活基因的鉴定
• 3.1 研究目的与意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂及其它物品
• 3.2.4 APP菌株的复苏与培养
• 3.2.5 生物被膜形成突变体的筛选及保存
• 3.2.6 试管法生物被膜的检测（Tube ring test）
• 3.2.7 反向PCR
• 3.2.8 PCR验证转座子插入的方向
• 3.2.9 Southern blot
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 复苏突变体的PCR鉴定
• 3.3.2 生物被膜形成突变体的筛选
• 3.3.3 APP参考菌株和地方分离株的生物被膜形成
• 3.3.4 试管生物被膜形成试验
• 3.3.5 反向PCR的结果
• 3.3.6 hns基因BLAST结果与分析
• 3.3.7 转座子插入方向的PCR鉴定
• 3.3.8 Southern blot的结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于生物被膜的形成
• 3.4.2 被阻断基因序列的获取
• 4 HNS基因的结构与功能的初步研究
• 4.1 研究目的与意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 载体与质粒
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 酶和主要试剂及其配制
• 4.2.5 主要仪器设备
• 4.2.6 实验动物
• 4.2.7 hns基因及其蛋白H-NS的生物信息学分析
• 4.2.8 hns互补菌株的构建及在亲本菌中的过表达
• 4.2.9 APP菌株的RT-PCR
• 4.2.10 生物被膜的定性分析
• 4.2.11 生物被膜的定量分析
• 4.2.12 突变菌株的溶血活性的研究
• 50的测定'>4.2.13 突变菌株的小鼠毒力试验及LD₅₀的测定
• 4.2.14 实时荧光定量PCR检测hns基因和毒素的表达
• 4.2.15 重组H-NS蛋白对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 H-NS的氨基酸序列的同源性比较和结构域的预测
• 4.3.2 hns互补质粒的构建
• 4.3.3 hns互补菌株的PCR鉴定
• 4.3.4 不同方法提取RNA
• 4.3.5 RT-PCR检测hns基因的表达
• 4.3.6 APP菌株的生物被膜形成
• 4.3.7 APP不同菌株间生长特性的比较
• 4.3.8 APP不同菌株间溶血活性的比较
• 4.3.9 小鼠的的毒力试验
• 4.3.10 实时荧光定量RT-PCR
• 4.3.11 hns基因的扩增、克隆及鉴定
• 4.3.12 H-NS的表达与纯化
• 4.3.13 H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 关于RNA的提取
• 4.4.2 关于内参的选择
• 4.4.3 关于实时荧光定量RT-PCR
• 4.4.4 H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• Curriculum Vitae