论文题目: 松口蘑发酵菌丝体糖蛋白抗肿瘤活性及其作用机理研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 魏元青
导师: 陶文沂
关键词: 松口蘑,糖蛋白,结构,抗肿瘤,联合用药,凋亡,急性毒性
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 松口蘑[Tricholoma matsutake （s.Ito et Imai ） Sing.]是世界上名贵的野生食用菌,提取物具有增强免疫、抗肿瘤活性。本论文在实验室前期工作的基础上,对松口蘑一种抗肿瘤糖蛋白的分离纯化和结构鉴定、体外抗肿瘤及抗瘤谱、联合化疗、抗肿瘤作用机理及急性毒性等进行了研究。采用DEAE-Sepharose F.F和AKTA快速分离制备系统对水浸提松口蘑发酵菌丝体的粗提物进行分离纯化,得到均一组分MTS03。冻干后样品为白色絮状物质,易溶于水,不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂,样品中多糖和蛋白的含量分别为12.46%和86.53%,MALDI-TOF-MS测定分子量为22908.93。红外光谱、紫外光谱的分析结果表明,MTS03含有O-糖肽键,糖链部分以α-型糖苷键连接,氨基酸自动分析仪分析含有18种氨基酸,气相色谱分析单糖组成为阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1.46: 2.22: 7.74: 1.29:0.61,是一种微观非均一性糖蛋白,经肽谱分析鉴定结合MTS03的分子量和性质研究,初步认为MTS03可能是一种新的糖蛋白。采用MTT法检测MTS03对肿瘤细胞的抑制增殖作用和抗瘤谱,以及对正常细胞的毒性,研究了MTS03的热稳定性和不同批次发酵生产的菌丝提取的糖蛋白MTS03对肿瘤细胞的抑制作用。对S180、MCF-7、Bel-7402及正常肝细胞L-02的体外抑制活性研究,作用24 h的IC50分别为26.64、24.32、77.98、1366.49μg/mL,作用48 h的IC50为15.02、9.37、25.28、190.60μg/mL,作用72 h的IC50为8.18、7.55、11.39、97.21μg/mL。作用24 h对三种细胞的治疗指数TIS180、T IMCF-7、T IBel-7402分别为51.29、56.19、17.52,随作用时间延长,对正常细胞也表现出一定的毒性,治疗指数也相对减小,高浓度和长作用时间对L-02的抑制作用较大。MTS03具有较广的抗瘤谱,对多种来源细胞均有一定的抑制作用,其中对MCF-7、HL-60和C6等肿瘤细胞的效果最好。MTS03具有一定的热不稳定性,在常温下稳定,但温度超过56℃后随时间延长MTS03逐渐失去活性。不同发酵批次的菌丝提取的MTS03对S180和MCF-7细胞具有基本相同的杀伤活性,表明MTS03在发酵、提取过程中具有良好的可重复性和稳定性,以及MTS03的制备工艺的可行性。考察了MTS03联合5-Fu体外对MCF-7和Bel-7402细胞的增殖抑制的影响及增效减毒作用,结果发现合用后对两种细胞的q值均大于0.85,在合适的浓度q值大于1.25,具有良好的增效作用。MTS03与5-Fu合用后,显著增加了肿瘤细胞对5-Fu的敏感性,单独使用5-Fu对MCF-7细胞的IC50为6.37μg/mL,而使用2.5、5μg/mL MTS03与不同浓度5-Fu合用时, IC50分别降低为0.45μg/mL和0.37μg/mL,为原来浓度的1/14.16和1/17.22,而降低两者浓度后合用对L-02细胞的毒性极小,从而达到了增效减毒的作用。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 绪论
1.1 糖蛋白的结构分析
1.1.1 糖蛋白的结构特点
1.1.2 糖蛋白结构研究
1.2 多糖及其复合物抗肿瘤机理研究
1.2.1 直接杀伤肿瘤细胞
1.2.2 免疫调节功能
1.2.3 抗肿瘤血管生成
1.3 松口蘑研究进展
1.3.1 松口蘑简介
1.3.2 松口蘑栽培研究进展
1.3.3 松口蘑活性物质的研究
1.4 课题的立题背景和主要内容
第二章 松口蘑发酵菌丝体糖蛋白的分离纯化及结构鉴定
2.1 引言
2.2 实验材料、仪器
2.2.1 实验材料
2.2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 糖蛋白的提取
2.3.2 糖蛋白的分离纯化
2.3.3 松口蘑糖蛋白纯度鉴定及分子量的测定
2.3.4 蛋白质含量测定
2.3.5 多糖含量分析
2.3.6 单糖组成分析
2.3.7 氨基酸组成分析
2.3.8 糖肽键的特征分析
2.3.9 多糖分子构型分析—红外光谱测定
2.3.10 糖蛋白的肽谱分析
2.3.11 胰蛋白酶活性测定(Worthington 法)
2.4 实验结果
2.4.1 松口蘑糖蛋白的分离纯化
2.4.2 纯度鉴定及分子量的测定
2.4.3 蛋白质和多糖含量分析
2.4.4 单糖组成分析
2.4.5 氨基酸组成分析
2.4.6 糖肽键的特征分析
2.4.7 多糖分子构型分析—红外光谱测定
2.4.8 MTS03 的胰蛋白酶酶解质量肽谱
2.4.9 MTS03 对胰蛋白酶活性的抑制性状
2.5 讨论
2.6 本章小结
第三章 松口蘑糖蛋白MTS03体外抗肿瘤活性及抗瘤谱的研究
3.1 引言
3.2 实验材料、仪器
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养
3.3.2 肿瘤细胞生长抑制实验:MTT 法
3.3.3 MTS03 对细胞生长曲线的影响
3.3.4 MTS03 热稳定性研究
3.3.5 批次间重复实验
3.3.6 抗瘤谱研究
3.3.7 实验数据处理
3.4 实验结果
3.4.1 糖蛋白MTS03 体外抗肿瘤活性实验
3.4.2 细胞生长曲线:活细胞计数
3.4.3 MTS03 的抗瘤谱研究
3.4.4 MTS03 热稳定性实验
3.4.5 不同批次发酵松口蘑菌丝提取的MTS03 对肿瘤细胞的影响
3.5 讨论
3.6 本章小结
第四章 松口蘑糖蛋白 MTS03 与5-Fu 联合用药的研究
4.1 引言
4.2 实验材料、仪器
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验试剂
4.2.3 实验仪器
4.3 实验方法
4.3.1 MTS03 与5-Fu 单独及联合使用对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Bel-7402 的影响
4.3.2 MTS03 与5-Fu 单独及联合使用对人正常肝细胞L-02 的细胞毒性作用
4.3.3 5-Fu 体外对人乳腺癌细胞MCF-7 单独及联合使用MTS03 的IC_(50) 测定
4.3.4 q 值的计算
4.3.5 数据分析
4.4 实验结果
4.4.1 5-Fu 及MTS03 单独使用对MCF-7、Bel-7402、L-02 细胞增殖的影响
4.4.2 MTS03与5-Fu联合使用后对MCF-7、Bel-7402、L-02细胞增殖的影响
4.4.3 5-Fu 体外对人乳腺癌细胞MCF-7 单独及联合使用MTS03 的IC_(50) 测定
4.4.4 MTS03 与5-Fu 联合使用后对MCF-7、Bel-7402 细胞作用的q 值
4.5 讨论
4.6 本章小结
第五章 松口蘑糖蛋白MTS03抗肿瘤机理研究
5.1 引言
5.2 实验材料、仪器
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验试剂
5.2.3 实验仪器
5.3 实验方法
5.3.1 HE 染色观察细胞结构
5.3.2 扫描电镜观察细胞形态
5.3.3 检测细胞坏死与凋亡:Annexin V-FITC/ PI 双染色流式细胞术检测
5.3.4 流式细胞仪分析DNA 含量及细胞周期
5.3.5 细胞总DNA 提取及琼脂糖凝胶电泳检测
5.3.6 流式细胞仪检测基因蛋白的表达
5.4 实验结果
5.4.1 HE 染色观察细胞结构
5.4.2 扫描电镜观察细胞形态
5.4.3 检测细胞坏死与凋亡:Annexin V/ PI 双染色流式细胞术检测
5.4.4 MTS03 对MCF-7 细胞周期的影响
5.4.5 DNA 凝胶电泳
5.4.6 流式细胞仪检测基因蛋白的表达
5.5 讨论
5.5.1 细胞形态
5.5.2 细胞坏死与细胞凋亡
5.5.3 细胞周期
5.5.4 凋亡相关基因蛋白的表达
5.6 本章小结
第六章 松口蘑糖蛋白 MTS03 的急性毒性实验研究
6.1 引言
6.2 实验材料、仪器
6.2.1 实验材料
6.2.2 实验仪器
6.3 实验方法
6.3.1 预试验
6.3.2 动物分组
6.3.3 小鼠体重变化情况
6.3.4 小鼠白细胞计数
6.3.5 组织病理学检查
6.3.6 数据分析
6.4 实验结果
6.4.1 致死量
6.4.2 LD_(50)
6.4.3 体重变化
6.4.4 器官系数
6.4.5 白细胞计数
6.4.6 组织病理学检查
6.5 讨论
6.6 本章小结
论文结论
论文创新点
参考文献
博士研究生期间发表的论文
论文中相关缩写的中英文对照
发布时间: 2006-07-20
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