玉米籽粒中新microRNA的鉴定及功能初探

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是一种内源性小分子非编码RNA,大约由2125个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA,通过断裂靶标mRNAs或翻译水平的抑制而调节基因的表达。miRNA参与很多重要的生命过程,如参与细胞生长、发育、基因转录、翻译等诸多生命活动的调控过程。新的miRNA的发现和miRNA功能的研究将极大丰富人们对生命世界的认识,并对一些重大疾病发病机制的研究和设计新的治疗策略带来突破。本研究以玉米籽粒成熟过程不同时期miRNA表达谱测序结果中筛选出的23条表达差异明显的miRNA为研究对象,采用生物信息学方法分析了结构特征;预测了23条miRNAs的靶基因;并从授粉后4天,5天,6天,7天,9天,10天,12天,14天,18天,20天,22天检测了23条miRNA的表达水平;并且对玉米籽粒总RNA的提取方法进行了改良。结果如下:1.与miRNA数据库（ Maize miRNA数据库,Rice miRNA数据库和Arabidopsis miRNA数据库）进行比对,结果发现,19条序列分属6个Maize miRNA家族,另外4条与现有数据库没比对上;2.通过在线预测其前体序列,经分析这23条RNA序列的前体大小分布在100-260nt之间,平均长度为149bp,其中有70%的microRNA长度在100140nt之间,最长的达到了260nt;3.通过在线软件预测其二级结构,经预测,这23条miRNA序列均具有典型的二级结构;4.根据测序reads数分析miRNA在各个时期的表达情况发现,表达丰度最高的为miRNA1,属于miR156家族,表达丰度为308788.1表达丰度较低的为miRNA15、miRNA16,属于MIR167家族,平均表达丰度为24689.6;miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4、miRNA5、miRNA10、miRNA12、miRNA13、miRNA15和miRNA16表达量持续升高;miRNA6, miRNA7和miRNA8在第7天的表达水平达到了最高;miRNA9,miRNA14在第12天表达量达到最高;miRNA11、miRNA17、miRNA18、miRNA19、miRNA20、miRNA22和miRNA23表达量在持续下降;5.通过Northern blot鉴定miRNA9、miRNA10、miRNA12、miRNA21、miRNA22和miRNA23及它们的表达情况,经分析,它们的表达趋势与测序结果相似;6.通过对靶基因预测得到15个靶基因,根据参考前人的研究结果分析这些靶基因的作用发现这些靶基因中有的与玉米籽粒的发育存在较大的相关性。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 microRNA 的概述
• 1.2 miRNA 的特征
• 1.3 microRNA 的合成
• 1.4 miRNA 与siRNA
• 1.5 miRNA 的作用
• 1.6 miRNA 的发现
• 1.6.1 小片段 RNA 克隆
• 1.6.2 miRNAs 的筛选
• 1.6.3 miRNAs 的生物信息学分析
• 1.7 miRNAs 的靶标预测与验证
• 1.7.1 miRNAs 靶标的生物信息学分析
• 1.7.2 miRNAs 靶标的实验验证
• 1.8 microRNA 定量检测方法
• 1.8.1 Northern blotting 法
• 1.8.2 实时荧光定量PCR 法[81]
• 1.8.3 克隆测序法
• 1.8.4 新一代大规模测序技术
• 2. 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 实验主要仪器设备
• 3.1.4 主要的缓冲液和试剂成分及配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 玉米籽粒miRNA 建库
• 3.2.1.1 RNA 相关实验操作原则
• 3.2.1.2 RNA 实验相关物品的处理
• 3.2.1.3 总RNA 的提取
• 3.2.1.4 总RNA 的纯化
• 3.2.1.5 Illumina sequencing 技术测序
• 3.2.1.6 生物信息分析内容
• 3.2.2 同源性分析
• 3.2.3 二级结构预测
• 3.2.4 测序结果分析RNA 表达量
• 3.2.5 靶标预测
• 3.2.6 Northern Blot 试验验证miRNA 及其表达情况
• 3.2.6.1 总RNA 的提取同上
• 3.2.6.2 Northern blot 验证
• 3.2.7 5’RACE 验证靶基因
• 3.2.7.1 5’接头的连接
• 3.2.7.2 Trizol 法纯化
• 3.2.7.3 cDNA 第一链的合成
• 3.2.7.4 PCR 扩增
• 3.2.7.5 巢式PCR
• 4 结果与分析
• 4.1 玉米总RNA 提取结果
• 4.2 microRNA 序列
• 4.3 二级结构预测结果
• 4.4 同源性分析
• 4.5 miRNA 表达量分析
• 4.6 miRNA 靶基因的预测
• 4.7 Northern Blot 实验验证miRNA 及其表达情况
• 4.8 5’RACE 实验验证靶基因
• 4.8.1 5’接头的连接
• 4.8.2 PCR 扩增
• 5 结论与讨论
• 5.1 改良CTAB 法提取玉米籽粒总RNA
• 5.2 新一代测序技术检测miRNA
• 5.3 microRNA 保守性分析
• 5.4 玉米microRNA 靶序列的功能多样性
• 5.5 microRNA 表达
• 5.6 下一步的研究
• 5.7 microRNA 研究的发展前景
• 参考文献
• Abstract