大豆农杆菌介导转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL 基因转化研究

论文摘要

大豆是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物,也是植物蛋白质的主要来源。随着大豆基因组测序的完成和人们对转基因作物认同度的增加,进行大豆功能基因组和转基因大豆种质创新研究已越来越引起各国科学家的重视。尽管大豆对农杆菌较敏感,但由于组织培养再生性差与其它作物相比大豆难于转化且转化效率较低。较低的转化效率限制了大豆功能基因组的研究和转基因大豆新品种研发。本研究通过对外植体、基因型、农杆菌菌液、抗氧化剂、共培养条件等因素优化了大豆农杆菌介导子叶节转化体系,目前在本实验中采用特异的转化受体大豆转化效率平均可达1.5%左右,个别转化事件转化效率达到8.83%。所优化的适于大豆转化系为：以发芽一天的YC-1和YC-2二个品种子叶节为外植体,采用OD6500.8左右的农杆菌菌液共侵染外植体30 min,在含有25mg/L LA的共培养基光照培养4天然后在SI和SE培养基上诱导芽的再生,再在RM诱导生根,最快的可在80天左右得到大豆转基因苗。采用已优化的大豆转基因体系,采用农杆菌介导法将Sporamin和Chitinase KDEL两个基因导入大豆中,得到经过草丁膦抗性鉴定和PCR技术鉴定的阳性苗25株。田间观察试验表明这二个基因具有抗红蜘蛛的功能,但棉铃虫喂饲试验表现为不抗。’关于这二个基因的功能,Southern杂交和RNA表达分析还有待于进一步的研究。

论文目录

• 致谢
• 目录
• 缩略图表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 外源基因遗传转化在大豆育种中的应用
• 1.2.1 抗除草剂转基因大豆
• 1.2.2 抗病虫转基因大豆
• 1.2.3 大豆品质的改良
• 1.3 大豆遗传转化体系的研究进展
• 1.3.1 大豆基因枪法
• 1.3.2 大豆农杆菌介导法
• 1.3.3 影响大豆遗传转化的因素
• 1.3.3.1 基因型
• 1.3.3.2 外植体
• 1.3.3.3 农杆菌菌株
• 1.3.3.4 筛选剂
• 1.3.3.5 抗氧化剂
• 1.3.3.6 培养条件的影响
• 1.4 论文的主要研究内容和意义
• 2 大豆农杆菌介导子叶节遗传转化体系的优化研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 大豆农杆菌介导转化方法
• 2.1.4 大豆转化主要培养基配方
• 2.1.5 大豆子叶节农杆菌介导转化体系优化处理
• 2.1.6 GUS瞬时表达分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同外植体对芽诱导的影响
• 2.2.2 不同基因型对大豆子叶节农杆菌介导GUS瞬时表达的影响
• 2.2.3 不同基因型对大豆芽诱导再生的影响
• 2.2.4 农杆菌对大豆子叶节农杆菌介导GUS瞬时表达的影响
• 2.2.5 不同抗氧化剂对大豆子叶节外植体芽诱导再生的影响
• 2.2.6 不同共培养条件对大豆子叶节农杆菌介导GUS瞬时表达的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 不同外植体对大豆转基因的影响
• 2.3.2 不同基因型对大豆转基因的影响
• 2.3.3 不同菌液条件对大豆转基因的影响
• 2.3.4 不同浓度的抗氧化剂对大豆转基因的影响
• 2.3.5 不同共培养条件对大豆转基因的影响
• 3 大豆农杆菌介导SPORAMIN和CHITINASE KDEL基因转化研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 农杆菌菌株和载体
• 3.2.3 试剂
• 3.3 研究方法
• 3.3.1 载体的改建
• 3.3.2 质粒及转基因苗PCR鉴定的方法
• 3.3.3 大豆子叶节农杆菌介导SPORAMIN和CHITINASE KDEL基因转化
• 3.3.4 转基因植株除草剂涂抹试验
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 质粒的鉴定
• 3.4.2 大豆农杆菌介导转化SPORAMIN和CHITINASE KDEL基因研究
• 3.4.3 SPORAMIN和CHITINASE KDEL转化植株的鉴定
• 3.4.4 SPORAMIN和CHITINASE KDEL有可能抗红蜘蛛作用
• 3.5 讨论
• 4 结论和展望
• 参考文献