褶纹冠蚌超氧化物歧化酶基因和溶菌酶基因的分子克隆及表达特征

论文摘要

褶纹冠蚌（Cristaria plicata）是我国重要的“淡水育珠蚌”之一,开展其分子免疫的研究不仅具有理论意义,而且具有重要的应用价值。本文对褶纹冠蚌超氧化物歧化酶（CpSOD）和溶菌酶（CpLYS）的cDNA进行了克隆,并研究了这两种酶的表达特征。利用RACE-PCR及同源克隆方法,克隆出CpSOD cDNA全长和CpLYS的部分cDNA。CpSOD基因全长891bp,其中编码区468bp,5’端不翻译区83bp,3’端不翻译区340 bp（含ployA尾24 bp）。该基因序列开放阅读框编码155个氨基酸,预测的分子量大小为15.8kDa,等电点为5.80。通过多序列比对结果发现,CpSOD和许多动物的Cu/Zn-SOD相似,均含有保守的4个铜结合位点和4个锌结合位点,信号肽预测未发现信号肽,表明CpSOD是胞质Cu/Zn-SOD。BLAST分析显示CpSOD与其它动物的Cu/Zn-SOD有很高的同源性,利用不同动物的胞质Cu/Zn-SOD氨基酸序列构建系统发育树,结果表明褶纹冠蚌与太平洋牡蛎、栉孔扇贝、紫贻贝共同形成一个小分支。CpLYS的部分cDNA包括530bp,3’端不翻译区259 bp（含ployA尾29bp）,共编码89个氨基酸残基。BLAST分析发现CpLYS的部分cDNA序列与其它动物的i-型溶菌酶有较高的同源性,所以推测CpLYS为i-型溶菌酶。利用RT-PCR分析检测CpSOD和CpLYS基因在注射嗜水气单胞菌后的表达情况,结果表明经注射嗜水气单胞菌后,血细胞中CpSOD基因的表达明显增加,到12h后达到最大值,随后表达下降,至48h后恢复至原有水平;而CpLYS基因在注射嗜水气单胞菌后表达量一直增加,至48h后达到最大值,结果说明褶纹冠蚌在受到病原体侵害后,其体内的超氧化物歧化酶和溶菌酶在免疫中均具有防御作用。利用RT-PCR分析检测CpSOD和CpLYS在各组织中的表达情况,结果表明,CpSOD基因在血液、外套膜、鳃、肝胰腺和闭壳肌中均有表达,CpLYS基因在血液、外套膜、鳃、肝胰腺和闭壳肌中也均有表达。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 贝类的免疫学研究
• 1.1 贝类的细胞免疫
• 1.2 贝类的体液免疫
• 1.2.1 水解酶类
• 1.2.2 氧化酶类和抗氧化酶类
• 1.2.3 凝集素
• 1.2.4 抗菌肽
• 1.2.5 单核因子
• 1.2.6 溶血素
• 1.2.7 硝酸盐超氧化物阴离子
• 2 超氧化物歧化酶基因研究现状
• 2.1 SOD的发现
• 2.2 SOD的种类与分布
• 2.2.1 Cu/Zn-SOD
• 2.2.2 Mn-SOD
• 2.2.3 Fe-SOD
• 2.3 SOD的结构
• 2.3.1 Cu/Zn-SOD
• 2.3.2 Mn-SOD
• 2.3.3 Fe-SOD
• 2.4 SOD的生理功能
• 2.5 SOD的理化性质及酶活影响因素
• 2.5.1 SOD的理化性质
• 2.5.2 SOD的活性影响因素
• 2.5.2.1 温度对SOD活性的影响
• 2.5.2.2 pH对SOD活性的影响
• 2.5.2.3 变性剂对SOD活性的影响
• 2.5.2.4 金属辅基对SOD活性的影响
• 2.5.2.5 溶液介电常数对SOD活性的影响
• 2.6 SOD的应用
• 3 溶菌酶基因研究现状
• 3.1 溶菌酶的发现
• 3.2 溶菌酶的种类与分布
• 3.3 溶菌酶的活性中心及作用机理
• 3.4 溶菌酶的生理功能
• 3.5 溶菌酶的理化性质
• 3.6 溶菌酶的应用
• 4 本研究的意义
• 第二章 褶纹冠蚌超氧化物歧化酶基因的克隆及表达特征
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 试验材料
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 血细胞的收集和RNA的提取
• 2.4.2 褶纹冠蚌SMART cDNA的合成
• 2.4.3 SOD基因中间片段的克隆
• 2.4.4 RACE-PCR方法扩增褶纹冠蚌SOD基因的cDNA全长
• 2.4.5 测序及序列分析
• 2.4.6 SOD的表达特征
• 2.4.7 胞内Cu/Zn-SOD的系统发育树分析
• 3 结果
• 3.1 褶纹冠蚌血液中总RNA的纯度
• 3.2 褶纹冠蚌SOD基因的cDNA序列
• 3.3 SOD基因的核苷酸和推导的氨基酸序列特征分析
• 3.4 系统发育分析
• 3.5 CpSOD的表达特征
• 3.5.1 细菌刺激后CpSOD表达的变化
• 3.5.2 CpSOD在褶纹冠蚌各组织中的表达
• 4.讨论
• 第三章 褶纹冠蚌溶菌酶基因的克隆及表达特征
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 RNA的提取和SMART cDNA的合成
• 2.2.2 溶菌酶基因中间片段的克隆
• 2.2.3 RACE-PCR方法扩增褶纹冠蚌溶菌酶基因的cDNA全长
• 2.2.4 溶菌酶的表达特征
• 3 结果
• 3.1 褶纹冠蚌溶菌酶基因的部分cDNA序列
• 3.2 褶纹冠蚌溶菌酶基因的部分cDNA序列的分析
• 3.3 细菌刺激后CpLYS表达的变化
• 3.4 CpLYS在各组织中的表达情况
• 4 讨论
• 第四章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果