湖南地区临床分离革兰阴性杆菌产金属β-内酰胺酶研究

论文摘要

目的（1）了解本院对碳青霉烯类敏感性下降的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的临床分布及耐药特征。（2）探讨湖南地区临床分离革兰阴性杆菌产金属p-内酰胺酶的分子流行病学特征。方法（1）连续收集湘雅医院2011年1月1日-6月30日临床分离非重复对碳青霉烯类敏感性下降鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌；Vitek-2全自动微生物分析系统对病原菌进行鉴定；K-B法检测抗菌药物的敏感性,结果以软件WHONET5.4进行分析。（2）收集湖南地区15家医院2011年1月1日-6月30日临床分离非重复革兰阴性菌482株,采用双纸片协同试验和双纸片增效试验进行金属p-内酰胺酶表型筛查,对初筛阳性菌株再用E-test MBL做进一步验证。（3）对于金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,以PCR检测IMP、VIM-2、SIM、SPM、GIM及NDM-1共6种主要金属p-内酰胺酶基因,并对扩增产物进行测序及BLAST分析。（4）利用接合试验检测金属β-内酰胺酶基因是否可通过质粒转移；肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应（ERIC-PCR）分析IMP和VIM-2基因阳性菌株的同源性。（5）以产NDM-1型金属β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌总DNA为模板,PCR扩增NDM-1全长基因,并构建原核表达质粒pET-28a（+）-NDM-1。结果（1）本院193株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对19种抗菌药物的药敏结果显示：耐药率大于80%的抗菌药物达15种,以哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦和庆大霉素的耐药率最高,均为100%,较为敏感的药物为头孢哌酮/舒巴坦（39.4%）和米诺环素（44.6%）；39株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌仅对多粘菌素B和阿米卡星有较好的体外抗菌活性,敏感率分别为100%和41.0%,而对其他常用抗菌药物的耐药率均大于50.0%,尤其以头孢噻肟最高,耐药率为100%；发现13株泛耐药菌株,其中铜绿假单胞菌11株,鲍曼不动杆菌2株。（2）482株多重耐药革兰阴性杆菌中,金属β-内酰胺酶表型阳性共25株；经PCR和产物测序确证阳性为23株。其中,13株铜绿假单胞菌为IMP-9型,1株铜绿假单胞菌为IMP-1型；6株铜绿假单胞菌为VIM-2型；1株恶臭假单胞菌同时扩增出IMP-9和VIM-2基因,另外1株恶臭假单胞菌扩增出VIM-2基因；1株肺炎克雷伯菌同时扩增出NDM-1和IMP-4基因；未检测到SIM、SPM和GIM基因阳性菌株。（3）仅产NDM-1型金属β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌接合试验成功,ERIC-PCR分型结果显示14株产IMP菌株存在多个型别,而6株产VIM-2菌株为同一型别。（4）经PCR双酶切及测序验证,成功地构建了pET-28a（+）-NDM-1重组质粒。结论（1）本院对碳青霉烯类敏感性下降的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌多重耐药十分严重。（2）湖南地区产金属β-内酰胺酶菌株主要为铜绿假单胞菌,并且以IMP-9和VIM-2基因型为主。（3）发现了1株产NDM-1型金属β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌,为湖南地区首次报道。（4）成功构建了原核表达质粒pET-28a（+）-NDM-1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英汉縮略词对照表
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 第二章 结果
• 2.1 湘雅医院耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的耐药性分析
• 2.2 金属β-内酰胺酶表型检测及基因确证
• 2.3 菌株同源性分析
• 2.4 接合试验
• 2.5 NDM-1型金属β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达质粒的构建
• 第三章 讨论
• 3.1 临床分离菌株的耐药性分析
• 3.2 金属β-内酰胺酶表型检测及基因确证
• 3.3 菌株同源性分析
• 3.4 接合试验
• 3.5 NDM-1型金属β-内酰胺酶基因的克隆及原核表达质粒的构建
• 3.6 不足与展望
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果