迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白Sedlin与PAM14蛋白的相互作用

论文摘要

迟发性脊椎骨骺发育不良病（Spondyloepiphyseal dysplasia tarda, SEDT, MIM 313400）是一种X连锁隐性遗传病,主要累及脊椎椎体和承重大关节。其主要临床特征为:患者骨骼病变,常患骨关节炎,身高增长下降致短躯干性侏儒。SEDL基因的突变导致SEDT的发生（MIM 300202）。该基因定位于Xp22,全长20 kb,包含6个外显子。SEDL基因的表达产物为140个氨基酸组成的Sedlin蛋白,而且该蛋白高度保守,在人类和酵母具有相同的氨基酸序列。Sedlin蛋白是酵母TRAPP（transport protein particle）复合物中Trs20p亚基的同源物。目前认为TRAPPⅠ定位于高尔基复合体的顺面,为COPⅡ膜泡的受体,在从内质网到高尔基复合体的膜泡运输中发挥作用;TRAPPⅡ则主要作用于高尔基复合体内部的物质运输。酵母中Trs20p亚基是TRAPPⅠ、TRAPPⅡ所共有的,而且Trs20p亚基的失活具有致死效应,因此推测Sedlin蛋白质可能在物质运输过程即内质网-高尔基复合体之间的膜泡运输中发挥作用。为了了解哺乳动物细胞中Sedlin蛋白的功能,本课题组成员已经利用酵母双杂交系统筛选到了若干Sedlin蛋白的结合蛋白,其中包括一些已知蛋白,如胞内氯离子通道蛋白（chloride intracellular channel,CLIC）,EB病毒诱导的基因3（Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3）蛋白, MRG相关的蛋白PAM14（protein associated with MRG, 14 kD）,它们在细胞内均具有广泛的功能。先前已利用细胞生物学和分子生物学手段证实了在哺乳动物细胞内Sedlin蛋白与CLIC1是相互作用的,提示Sedlin蛋白可能在细胞发育中发挥重要作用。本研究是在上述研究的基础上,探寻Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内与PAM14蛋白是否存在相互作用,以进一步了解Sedlin蛋白的功能。首先构建真核表达重组质粒pCDGFP-SEDL、pCDGFP-PAM14,转染COS7细胞,通过免疫荧光方法,检测Sedlin蛋白、PAM14蛋白单独表达时在细胞内的定位情况;转染HEK 293T细胞,细胞裂解液进行Western blot鉴定蛋白质在哺乳动物细胞内的表达;构建重组质粒pGEX-3X-SEDL以表达融合蛋白GST-Sedlin,进行GST-pull down实验,检测Sedlin蛋白在体外与PAM14蛋白能否相互作用;进行免疫共沉淀和免疫荧光实验,检测在哺乳动物细胞内Sedlin蛋白与PAM14蛋白能否相互作用,能否共定位,共转染对蛋白质的定位有无影响。实验结果表明,Sedlin蛋白为一分子量约16kD的蛋白质,在胞质和胞核中均有分布,且主要表达于胞核;GFP-PAM14融合蛋白的分子量约为41kD,主要表达于细胞核,细胞质较少。GST-pull down实验结果表明,融合蛋白GST-Sedlin与PAM14蛋白之间存在相互作用;免疫共沉淀实验结果表明,在哺乳动物细胞内,Sedlin蛋白与PAM14蛋白之间存在相互作用;免疫荧光实验表明Sedlin蛋白与PAM14蛋白在细胞核存在共定位,且改变不同的蛋白标签,对共定位结果没有影响。综上,在哺乳动物细胞内,Sedlin蛋白与PAM14蛋白之间存在相互作用。PAM14,是由127个氨基酸残基组成的14 kD的高度保守的蛋白质。因其与MRG15（mortality factor 4-related gene family, MRG）基因家族和肿瘤抑制蛋白Rb蛋白（retinoblastoma tumor suppressor protein）相互作用,从而认为PAM14可能参与细胞生长、衰老、永生化等生命活动过程。我们的结果提示Sedlin可能在转录过程中发挥作用。

论文目录

• 一 缩略词表
• 二 中文摘要
• 三 英文摘要
• 四 正文
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 对本课题的进一步设想
• 五 其它工作
• 六 附录
• 个人简历
• 七 致谢
• 八 综述及参考文献