论文摘要
近年来,随着免疫学的不断发展以及血清学技术的应用,对双歧杆菌的鉴定和检测已从传统的平板计数方法发展到应用以抗原抗体反应为基础的各种酶免疫检测方法。在所有以抗原抗体反应为基础的检测方法中,酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是目前发展最为迅速并且较为完善的检测方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于利用了酶的高效率催化反应,间接放大了免疫反应的结果,使测定具有极高的灵敏度。而且,ELISA检测是在微量板中进行的,可以对大量样品同时进行检测,节省了时间。ELISA法中的双抗体夹心方法是常用来检测抗原的方法。目前所报道的相关研究中,都未能对利用双抗夹心ELISA方法检测双歧杆菌的反应条件进行建立并且没有对双歧杆菌进行定量检测的研究。ELISA方法克服了传统平板计数法的繁琐及分子生物学检测方法的费用昂贵等缺点,如能开发出其检测双歧杆菌的试剂盒将对实际应用将具有重要意义。故此,建立本课题展开这方面的研究。本课题中,自制并获得了高效价免疫血清;建立并优化了双抗夹心ELISA检测双歧杆菌的方法;用建立起的ELISA法组装试剂盒,对试剂盒进行方法学评价,非双歧杆菌属微生物对本试剂盒的检测结果无影响,重复性良好,对双歧杆菌的最低检出限为106cfu/mL（g）;检测时间为4h;用此试剂盒检测市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）进行检测时,与传统菌落计数方法相比,两种检测方法检测结果差异不显著（p>0.05）;用此试剂盒对自制含双歧杆菌的乳粉产品（1）进行检测时,与传统菌落计数方法相比,两种检测方法检测结果差异显著（p<0.05）。具体研究结果如下:1.免疫血清的制备制备出的兔抗长双歧杆菌免疫血清效价可达1:20480;鼠抗长双歧杆菌免疫血清效价达1:10240,均具有较高的效价。2.双抗夹心ELISA方法检测双歧杆菌最适反应条件的建立通过对双抗夹心ELISA检测方法中各反应条件进行摸索和比较,确定最佳反应条件为:最佳包被抗体和二抗反应浓度分别为1:160和1:5120;选用NBS和1%BSA-PBS分别作为包被缓冲液和封闭缓冲液;封闭30min;酶标抗体作1:2000的稀释之后作用90min;最后底物反应时间为20min;并且绘制了此方法检测双歧杆菌的标准曲线,得出了标准曲线方程:y=0.4461x-2.1503,相关系数为R2=0.9881。3. ELISA试剂盒的组装试剂盒主要组分有:兔抗长双歧杆菌免疫血清包被并封闭的8×12孔酶标板;工作浓度鼠抗长双歧杆菌免疫血清;工作浓度酶标抗体;长双歧杆菌标准品;底物溶液;终止液;浓缩洗涤液;操作方法及说明。4.试剂盒的方法学评价对所组建的双抗夹心ELISA检测双歧杆菌的试剂盒进行了方法学评价,包括:特异性、重复性、灵敏度。对分别含有4种不同双歧杆菌和七种不含双歧杆菌的样品进行检测,非双歧杆菌属微生物对检测结果没有影响,说明此方法具有较强的特异性;用五种不同样品对板间及板内分别做了重复性实验,仅有很好的几分样品变异系数超过10%,说明此试剂盒具有良好的重复性;对双歧杆菌的最低检出限为106cfu/mL;5.试剂盒的保存期实验通过对包被酶标板的保质期进行测定,实验证明,此试剂盒能在4℃的条件下保存一年以上;6.试剂盒在双歧杆菌检测中的应用采用所组建的双歧杆菌双抗夹心ELISA试剂盒对市售双歧杆菌的酸奶、奶粉及自制双歧杆菌乳粉进行检测与平板计数法相比。用此试剂盒检测市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）进行检测时,与传统菌落计数方法相比,两种检测方法检测结果差异不显著（p>0.05）;用此试剂盒对自制含双歧杆菌的乳粉产品（1）进行检测时,与传统菌落计数方法相比,两种检测方法检测结果差异显著（p<0.05）。