论文摘要
双元细菌人工染色体（BIBAC）是结合BAC和Agrobacterium Ti质粒的特点构建的载体,它能将大片段DNA直接转入植物,是基因图位克隆和功能分析的重要工具。BIBAC克隆在农杆菌EHA105中的稳定性是其遗传转化水稻（农杆菌介导的水稻转化）是否有意义的关键,BIBAC克隆完整转化水稻为大片段DNA种间和种内转化的可行性提供直接证据。本实验从玉米B73BIBAC文库中选取大小不同的克隆：插入片段小于50Kb的有4个克隆,80Kb左右的4个,100Kb左右的4个,120Kb左右的2个,160Kb左右的1个,检测其在农杆菌EHA105中的稳定性,同时把部分插入片段大小相近的克隆以pool的形式转化水稻中花11,并作了初步鉴定。得到的结果有：1.挑选的玉米B73 BIBAC克隆（E.coli DH10B）继代培养96h,质粒经限制性内切酶I-SceⅠ切后,脉冲电泳检测显示插入片段大小没有变化,说明玉米B73BIBAC克隆在大肠杆菌中保存约200代后仍然稳定。2.用直接法和间接法检测玉米B73BIBAC克隆在农杆菌EHA105中的稳定性实验中,根据农杆菌介导的水稻遗传转化中,农杆菌划线生长所需时间和农杆菌与愈伤共培养时间（约4天）,所以挑选的玉米B73 BIBAC质粒转化农杆菌后,培养48 h时继代1次再培养48 h,共培养96 h（约4天）。直接法检测稳定性时,提取的EHA105培养48 h和96 h时的质粒,经限制性内切酶I-SceⅠ切后,脉冲电泳检测显示插入片段大小基本不变,说明BIBAC克隆在农杆菌中培养48h和96h过程中大部分呈稳定状态。间接法检测稳定性时,提取的EHA105质粒反转E.coli DH10B,再提取DH10B质粒,质粒经限制性内切酶NotⅠ切后脉冲电泳检测,与对照比较插入片段大小基本没有变化,再次说明玉米B73 BIBAC质粒在EHA105侵染水稻转化过程中基本稳定。3.水稻转化实验中T-DNA复合物形成是从载体的右端（RB）开始终止于左端（LB）, BIBAC载体RB端的筛选基因是hpt, LB端的筛选基因是gus,如果对抗性植株的PCR检测中hpt和gus都是阳性则可以初步证明携带大片段DNA的T-DNA已经完整整合受体基因组。本研究中插入片段大小相近的克隆（共18个克隆）以pool的形式转化水稻中花11,首先对111株抗性植株进行抗性基因hpt （hygromycin phosphotransferase gene） PCR检测,得到33株阳性植株；再对hpt阳性植株进行抗性基因gus （β-glucuronidase gene） PCR检测得到4株hpt和gus阳性植株,初步说明玉米B73 BIBAC能够成功转化水稻。4. Tail-PCR （thermal asymmetric interlaced PCR）扩增得到部分水稻阳性植株中插入的玉米大片段DNA的两端序列（载体内向侧翼序列）；Tail-PCR序列比对18个克隆的末端序列,确定了第5号转基因阳性植株是来自BIBAC b6克隆（插入片段约160kb）的转化植株；第5号阳性植株的Tail-PCR序列和BIBAC b6质粒末端序列的共同序列匹配到玉米B73基因组序列的第7染色体上的跨越164kb的区段,与估算的BIBAC插入片段大小相近。对此区段的分析发现该区域的重复序列占88.1%。因此,我们得出重复序列达88.1%的164kb的玉米基因组大片段DNA通过BIBAC载体在农杆菌的介导下能够完整整合进水稻基因组。