水稻T-DNA插入突变体的鉴定与一个迟抽穗突变体的初步研究

论文摘要

水稻是世界上主要的粮食作物。水稻在禾谷类作物中基因组最小，且易于体外操作与分化等优点，因此被确定为禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物。随着水稻基因组测序工作的完成，以功能基因组学研究为代表的后基因组时代已经到来，丰富的信息资源将为水稻功能基因的发掘创造十分有利的条件。用插入突变建立突变体库，是水稻功能基因组学研究的基本方法。 本研究通过对水稻中花11的T-DNA插入突变群体的鉴定和分析，为水稻功能基因组研究提供材料和技术平台。主要研究结果如下： 1 在本实验室已建立的水稻T-DNA插入标签系的基础上，对其中部分T1代株系进行了田间调查和初步筛选，获得多个具有突变表型的突变体株系，其突变表型包括抽穗期变异、株高变矮、寡分蘖，叶片卷曲，颖花开裂、粒型等类型。 2 对部分经过T0及T1代水稻转化植株的突变表型鉴定和除草剂Basra抗性筛选，且经过分子生物学验证，获得了一些与T-DNA共分离的突变体；并建立起一套适合水稻，高效简洁的扩增T-DNA侧翼序列的TAIL-PCR方法体系。 3 从T-DNA插入突变体库中筛选到一个是单拷贝的且与T-DNA共分离的迟抽穗突变体M29，并经过TAIL-PCR法分离和序列测定得到未知的水稻侧翼序列，通过国际水稻基因组核酸数据库在线分析，得到了插入位点序列的相关信息，包括在染色体上的位置及可能编码的蛋白。 4．在TIGR基因组研究中心的水稻核苷酸数据库中分析预测了突变体M29被插入基因lh（暂命名），并通过长距离PCR法获得该基因片段，大约为5Kb。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 水稻突变体库的构建和研究
• 1.1.1 水稻转座子标签技术
• 1.1.1.1 转座子标签突变体库
• 1.1.1.2 反转录转座子标签突变体库
• 1.1.2 水稻T-DNA插入标签技术
• 1.1.2.1 T-DNA插入标签技术的原理及特点
• 1.1.2.2 T-DNA插入标签的研究策略
• 1.1.2.3 水稻T-DNA插人饱和突变体库的构建
• 1.1.2.4 T-DNA插入突变体的研究进展
• 1.1.3 T-DNA或转座子插入侧翼序列获得的主要方法
• 1.1.3.1 质粒挽救（Plasmid rescue）
• 1.1.3.2 反向PCR（Inverse PCR）
• 1.1.3.3 PCR步行法（PCR-Walking）
• 1.1.3.4 热不对称交错式PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR）
• 1.2 水稻抽穗期的分子遗传学研究
• 1.2.1 抽穗期QTL定位进展
• 1.2.2 影响水稻抽穗期的因素
• 1.2.2.1 自身遗传因素
• 1.2.2.2 外界环境因素
• 1.2.3 抽穗期相关基因的克隆
• 1.2.4 水稻抽穗期遗传信号传导路径研究
• 1.2.5 展望
• 1.2.5.1 水稻抽穗期QTL基因与其他开花基因的同源性研究
• 1.2.5.2 水稻抽穗期主基因的鉴定、分布及其对育种的指导意义
• 1.3 本论文的研究目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂和引物
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 水稻基因组的提取
• 0代及T₁代插入标签系的性状变异调查'>2.2.2 转基因T₀代及T₁代插入标签系的性状变异调查
• 1代变异性状与T-DNA插入事件共分离关系的确定'>2.2.3 T₁代变异性状与T-DNA插入事件共分离关系的确定
• 1代的Basra抗性鉴定'>2.2.3.1 水稻T-DNA插入标签系T₁代的Basra抗性鉴定
• 1代转基因植株的PCR检测'>2.2.3.2 T₁代转基因植株的PCR检测
• 2.2.4 T-DNA插入侧翼序列的获得（TAIL-PCR）
• 2.2.5 TAIL-PCR产物的回收、克隆和测序
• 2.2.6 TAIL-PCR产物和生物信息学分析
• 2.2.7 迟抽穗相关基因的预测和PCR扩增
• 3 结果和分析
• 3.1 转化植株的鉴定
• 1代的表型鉴定'>3.1.1 水稻T-DNA插入标签系T₁代的表型鉴定
• 1代T-DNA插入标签系的Basra抗性分离比及其分析'>3.1.2 T₁代T-DNA插入标签系的Basra抗性分离比及其分析
• 3.1.3 突变株系和转化事件共分离的PCR检测
• 1代转基因植株插入位点数的初步鉴定'>3.2 T₁代转基因植株插入位点数的初步鉴定
• 3.3 T-DNA插入水稻基因组未知侧翼序列的获得
• 3.4 TAIL-PCR产物的克隆和测序
• 3.4.1 TAIL-PCR产物的回收
• 3.4.2 TAIL-PCR产物的克隆
• 3.5 TAIL-PCR的产物测序结果及分析
• 3.5.1 测序结果
• 3.5.2 T-DNA插入水稻基因组侧翼序列的定位和注释
• 3.5.3 预测基因的结构分析和序列信息
• 3.5.4 预测基因的功能分析
• 3.6 T-DNA侧翼序列的验证及T-DNA标记的利用
• 3.7 预测基因的PCR扩增
• 4 讨论
• 4.1 T-DNA插入事件和突变体的共分离关系
• 4.2 T-DNA插入位点和插入基因型分析的意义
• 4.3 TAIL-PCR扩增效率的优化
• 4.4 拟南芥和水稻开花相关基因的类比研究
• 5 进一步研究设想
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 在读期间发表论文
• 致谢