妊娠期糖尿病患者外周血白细胞NF-κB的表达及血清炎症因子水平的研究

论文摘要

【研究背景】妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期首次发生或发现的不同程度的糖代谢异常，包括糖尿病和糖耐量异常，不包括妊娠前已诊断的糖尿病患者。GDM发病率约为1％～14％，并有逐年增高的趋势。GDM可导致孕妇代谢功能紊乱，容易发生巨大儿、羊水过多、自然流产、胎儿畸形、胎儿窘迫、死胎、死产、新生儿低血糖、低钙血症及高胆红素血症、孕妇酮症酸中毒等，对母婴健康危害严重，因此一直是产科的临床防治重点。过去GDM的研究多集中于产科领域，涉及GDM的筛查、诊断、预防、治疗及母婴预后，旨在为临床提供干预依据，避免母婴发生以上不良后果。随着人们对GDM认识的加深，发现其与2型糖尿病（Type 2 diaetes mellitus，T2DM）临床表现极其相似，认为其与2型糖尿病有着相似的发病机理，即遗传基因缺陷基础上存在胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）和胰岛素分泌功能不足。不同的是妊娠期糖尿病是可逆的，结束妊娠后一般可恢复正常，但有1／3的病人于产后5～10年转为T2DM，故认为GDM为T2DM的前期阶段。研究其对研究T2DM的发病、诊断、治疗具有重要意义，近年来GDM的研究逐渐受到内分泌领域的关注。炎症与2型糖尿病胰岛素抵抗关系为目前糖尿病发病机制的一个研究热点，作为借鉴，炎症是否也为妊娠期糖尿病胰岛素抵抗的一个重要机制呢?现阶段，炎症与妊娠期糖尿病相关的研究还停留于一些炎症细胞因子与胰岛素抵抗及GDM的发病关系上，且国内多停留于流行病学研究，对于炎症通路的探索就更少了。随着一些基础研究和大型糖尿病（diaetes mellitus，DM）预防试验的结果揭晓，如Yuan等用大剂量的水杨酸类制剂逆转了肥胖啮齿动物的高血糖、高胰岛素血症和血脂异常，发现大剂量水杨酸类药物降低血糖是通过核因子kappa B抑制物（inhibitor kappa B，IκB）激酶β（IκB kinaseβ，IKKβ）起作用，大剂量阿司匹林逆转了fa／fa大鼠和ob／ob小鼠的IR。在WOSCOPS研究中有134例发展为T2DM，普伐他汀组较对照组DM发病的风险降低了30％，且普伐他汀降低了白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-a）、白介素-8（interleukin-8，IL-8）和C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）的浓度，该作用独立于其降脂效应，提示其预防DM的效应与其抗炎作用相关。TRIPOD试验中曲格列酮（Troglitazone，TZD）降糖药是通过氧化物酶体增生物激活受体γ（peroxisome Proliferator-activated receptor，PPARγ）的激动剂，改变控制脂肪合成、脂肪细胞分化、脂肪酸摄取等基因的表达而起作用。此外，TZD还具有抗炎作用，能抑制多种细胞因子的产生和巨噬细胞的活化，能降低T2DM患者CRP、白细胞计数等炎症标记物的水平，显示出对T2DM的预防作用可能部分与炎症机制有关。这些进一步支持了DM的炎症病因学理论。炎症因子通常通过激活c-Jun氨基端激酶（c-Jun-NH2-terminal kinase，JNK）或核转录因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）两条通路引起胰岛素抵抗。JNK可以直接使胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的第302位（Ps302）和307位（Ps307）丝氨酸磷酸化，阻断胰岛素信号传导。通常NF-κB与其抑制物（inhibitor kappa B，IκB）结合，以无活性的形式存在于细胞浆内。核因子κB抑止物激酶（IκB kinase，IKK）经TNF-a、CRP、IL-1、IL-6等炎症因子激活后，使IκB磷酸化并与NF-κB解离，激活的NF-κB进入细胞核内，调节一系列炎症因子及炎症相关物质的基因转录和蛋白合成。IKK一方面可以直接引起IRS307位的丝氨酸磷酸化，终止胰岛素信号向磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3-K）传递，阻断胰岛素信号传导；另一方面可引起NF-κB抑制剂I-κB的磷酸化，进而活化NF-κB，通过刺激多种炎症因子如TNF-α、IL-6等的表达而间接引起IR的发生。作为经典非甾体类抗炎药的阿司匹林或水杨酸制剂，通过非环氧化酶途径抑制NF-κB及其上游的激活剂核因子κB抑止物激酶（IκB kinaseβ，IKKβ），打断了上述的恶性循环，改善了胰岛素抵抗。炎症学说的提出，为糖尿病的发病机制和开发预防糖尿病新药提供了又一个新的研究方向。而GDM被认为是T2DM的前期阶段，其提供了一个研究血糖紊乱相对早阶段的机会，对于研究糖尿病发病机理具有重要意义。本研究旨在通过对不同糖耐量妇女的血清白介素-6（interleukin-6，IL-6）、超敏C反应蛋白（high sensitive C-reactive protein，hs-CRP）水平进行检测，并与胰岛素抵抗相联系；同时检测不同糖耐量妇女外周血白细胞核内NF-κB的表达，进而探讨炎症在GDM发生、发展中的作用，为临床寻找更有效的诊断、预防和治疗手段提供参考。本研究包括以下两部分：第一章妊娠期糖尿病患者血清IL-6、hs-CRP水平与胰岛素抵抗的关系研究【研究目的】了解妊娠期糖尿病患者IL-6、hs-CRP的血清水平，初步探讨上述炎症因子水平与胰岛素抵抗、胰岛细胞功能之间的关系，进而初步探讨GDM发病与炎症反应的关系。【研究方法】1、选取2006年2月至2006年12月在我院产科门诊进行孕期健康检查的非糖尿病妊娠中晚期（24-36孕周）孕妇进行筛查。另选取孕龄期健康志愿女性作为正常对照组（control）组。两组孕妇均于24孕周后常规进行50g葡萄糖筛查试验，1h测血糖，阴性者（血糖值＜7.8mmol／L）纳入妊娠正常糖耐量（gestational normal glucose tolerance，NGT）组。若血糖≥7.8mmol／L，于3日后做100g OGTT试验，诊断根据美国糖尿病协会（America Diabetes Mellitus，ADA）2000年颁布的GDMC&C诊断标准（Carpenter-Coustan Critia），即空腹、服糖后1、2、3小时4个时点结果分别为5.3、10.0、8.6和7.8mmol／L，受试者两项或两项以上结果达到或超过诊断标准即诊断为GDM，纳入妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）组；一项结果达到或超过诊断标准为糖耐量低减（impaired glucose tolerance，IGT），不在本研究范围内；四项全部正常者，纳入NGT组。筛查时详细询问并记录年龄、孕前体重，测量腹围、身高、体重，计算体重指数（body mass index，BMI）（孕前BMI和筛查时BMI）。2、各组研究对象禁食8～14h后次晨抽取空腹静脉血，留取血清，置-20℃保存待测IL-6和hs-CRP。同时留取血样立即测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）和空腹胰岛素（fasting insulin，FINS），血糖采用葡萄糖氧化酶法，胰岛素采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法。3、放射免疫测定法（radioimmunoassay，RIA）测三组空腹血清IL-6浓度，免疫散射比浊法测三组血清hs-CRP浓度。利用Haffner等提出的稳态模型评估法（homeostasis model assessment，HOMA）评价胰岛素抵抗性和胰岛β细胞功能。稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-Insulin resistance，HOMA-IR）=FINS*FBG／22.5，胰岛素分泌指数（homeostasis model assessment-B，HOMA-B）=20*FINS／FBG-3.5。4、实验数据为计量资料，以均数士标准差（（?）±s）表示。采用SPSS13.0软件进行数据处理。偏态分布数据处理前进行相应统计学处理。三组资料比较用多样本均数比较的单向方差分析（One-way ANOVA），若方查分析显著，采用LSD法和SNK法进一步进行两两样本均数比较；应用双变量相关分析（Bivariate）分析两变量间相关性。检验标准为α=0.05。【研究结果】1、一般临床资料比较三组对象年龄、身高、孕前体重、孕前BMI均无显著性差异（P＞0.05）。两组孕妇孕周、腹围、孕中晚期体重亦无明显差异（P＞0.05），GDM组孕妇腹围、BMI显著高于NGT组（P＜0.05）。2、胰岛素抵抗和胰岛素分泌比较GDM组FBG显著高于NGT组和对照组（P＜0.01），但NGT组与对照组无明显差异（P＞0.05）；GDM组FINS显著高于NGT组和对照组（P＜0.01），NGT组显著高于对照组（P＜0.01）；GDM组HOMA-IR显著高于NGT组和对照组（P＜0.01），NGT组亦高于对照组（P＜0.05）；GDM组HOMA-B显著低于NGT组和对照组（P＜0.01），NGT组亦明显低于对照组（P＜0.05）。3、炎症因子水平比较GDM组、NGT组、对照组血清IL-6水平分别为（112.63±15.38）ng／ml、（65.08±9.99）ng／ml、（61.48±10.09）ng／ml，呈逐渐降低趋势，GDM组与NGT组、对照组均具显著性差异（P＜0.01），但NGT组与对照组无明显差异（P＞0.05）；GDM组、NGT组、对照组血清hs-CRP水平分别为（5.28±1.74）mg／L、（1.63±0.72）mg／L、（1.54±0.8）mg／L，呈逐渐降低趋势，GDM组与NGT组、对照组均具显著性差异（P＜0.01），但NGT组与对照组无明显差异（P＞0.05）。4、相关性分析Pearson相关分析显示GDM组中IL-6、hs-CRP与孕期腹围、体重、BMI均无明显相关（P＞0.05）。IL-6水平与FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-B显著相关，相关系数分别为0.384、0.463、0.485、-0.358（均P＜0.01）；hs-CRP水平与FBG、FINS、HOMA-IR、HOMA-B显著相关，相关系数分别为0.330、0.400、0.413、-0.340（均P＜0.01）；IL-6与hs-CRP显著相关，相关系数为0.814（P＜0.01）。【研究结论】1、妊娠中晚期NGT组、GDM组孕妇胰岛素抵抗较正常孕龄妇女逐渐加重，同时胰岛素分泌能力逐渐下降。2、GDM孕妇IL-6、hs-CRP血清水平明显升高，且与HOMA-IR、HOMA-B显著相关，故炎症因子IL-6、CRP可能通过多种机制加重IR，参与GDM的发病。第二章妊娠期糖尿病患者外周血白细胞NF-κB的表达【研究目的】了解妊娠期糖尿病患者NF-κB的表达水平，初步探讨NF-κB表达水平以及上述炎症因子水平与胰岛素敏感性之间的关系，进而探讨GDM发病与炎症反应的关系。【研究方法】采集三组实验对象外周抗凝血，分离白细胞，少量细胞涂片，行免疫荧光化学染色，剩余细胞提取核蛋白，行凝胶迁移电泳（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），对比各组NF-κB的表达水平。1、分组实验分组同第一部分，分别从GDM组、NGT组、对照组随机各抽取10例，作为本部分实验各组。2、外周血白细胞分离肘静脉采取实验对象空腹抗凝血5mL，加5-10倍体积的红细胞裂解液裂解红细胞，洗涤后离心，获得白细胞。3、核蛋白的提取将白细胞悬液离心后去上清夜，按文献步骤操作，先裂解胞膜，去胞质蛋白，再裂解核膜，收集上清液即为核蛋白提取物。4、各组NF-κB表达水平检测4．1免疫荧光化学染色法将白细胞悬液涂于0.1％多聚赖氨酸载玻片上，免疫荧光化学染色后，在共聚焦显微镜下摄像并观察NF-κB在胞浆和胞核内的分布情况。4．2凝胶迁移电泳（EMSA）法将分离的白细胞提取胞核蛋白。凝胶迁移电泳（EMSA）后观察胞核蛋白NF-κB迁移及与DNA结合情况，凝较成像分析系统摄像、分析结果。5、统计学处理实验数据为计量资料，以均数土标准差（（?）±s）表示。采用SPSS13.0软件进行数据处理。三组资料比较用多样本均数比较的单方差分析One-way ANOVA，若方差分析显著，采用LSD法和SNK法进一步进行两两样本均数比较。检验标准为α=0.05。【研究结果】GDM组外周血白细胞核内存在NF-κB激活。1、免疫荧光化学染色结果显示对照组细胞浆染色阳性，细胞核染色阴性，NGT组胞核内轻度阳性染色，GDM组胞核内显著阳性染色，说明GDM组NF-κB由细胞浆向细胞核移位，NF-κB被激活。2、EMSA结果进一步证实了GDM组NF-κB被激活，对照组及NGT组有较低水平的NF-κB表达，其灰度相对百分比分别为5.71％、8.66％，但两组间无显著性差异（P＞0.05），而GDM组可见明显的NF-κB表达，其灰度相对百分比分别为28.32％，与对照组相比较，几乎高出5倍（P＜0.001）。【研究结论】1、GDM组白细胞核内NF-κB激活，处于炎症状态。2、GDM组炎症介质升高，与NF-κB的激活有关。3、炎症因子IL-6、CRP可能通过NF-κB的激活进一步加重IR，参与GDM的发病。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 妊娠期糖尿病患者血清IL-6、CRP水平与胰岛素抵抗的关系研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• κB的表达'>第二章 妊娠期糖尿病患者外周血白细胞NF_κB的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 综述 炎症与妊娠期糖尿病
• 缩略名词表
• 致谢