鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究

论文题目: 鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 郜玉钢

导师: 王树志

关键词: 梅花鹿,牛病毒性腹泻病毒,克隆,表达,基因苗,敏感药物

文献来源: 吉林农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 1 从吉林省长春市双阳区梅花鹿流产胎儿肝脏病料中分离出的病毒,接种于MDBK传代细胞后出现了BVDV典型而规律的细胞病变,其理化特性与BVDV相同,致细胞病变作用可被BVDV国际标准株C24V株的牛阳性血清所阻断,电镜负染观察病料接种MDBK细胞的F1代浓缩病毒液,可见典型的BVDV粒子形态,从F1代浓缩病毒液中分别扩增出402bp(NS2-3)和706bp（E0）的目的片段,证明该毒株是BVDV,命名为CCSYD株。 2 对从吉林不同地区分离的4株（CCSYD株,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株）BVDV的NS2-3基因外源序列插入区进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并与BVDV其他株进行了同源性分析,CCSYD株属基因Ⅰb亚型,CCJYD株、CCKCD株、JLCYD株属待定基因型。 3 将CCSYD株BVDV的E0基因RT-PCR扩增目的片段进行了克隆和测序,将其与已报道的瘟病毒代表株相应序列做了比较,预测了E0蛋白的抗原表位、亲水性和等电点等。以E0基因为判定依据,CCSYD分离株也为基因Ⅰb亚型,E0基因的核苷酸序列可做为BVDV基因分型的依据。 4 成功构建了原核表达质粒pET28a/E0,重组菌在IPTG诱导下能表达目的蛋白,其含量占菌体总蛋白的9.25%。 5 成功构建了真核表达质粒PAX1/E0,并用脂质体转染BHK-21细胞,RT-PCR法检测到E0目的基因在BHK-21细胞进行了转录,间接ELISA法检测到已表达目的蛋白。 6 用梅花鹿源BVDV基因苗（PVAX1/E0）不同免疫剂量和免疫次数免疫家兔,既可产生体液免疫又可产生细胞免疫应答。基因苗高剂量组比低剂量组体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平高,基因苗免疫次数对体液免疫应答水平和细胞免疫应答均无影响。免疫的第42天基因苗免疫组抗体水平达到高峰,基因苗免疫组（免疫剂量1mg/ml以上）BVDV抗体应答水平高于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组,但免疫家兔的28天以前的结果则相反;免疫家兔产生的细胞免疫应答水平基因苗组均低于CCSYD灭活苗和C24V灭活苗免疫组。 7 采用组织细胞培养方法,测试了利巴韦林、黄芪、鱼腥草、干扰素a2b、莪术油、双黄连粉针剂在MDBK细胞体外培养中的最大安全浓度（最低稀释度）分别为(214)、（25）、（28）、（25）、（27）、（27）。药物抗梅花鹿源BVDV作用由强到弱的顺序:莪术油、鱼腥草、黄芪、干扰素、利巴韦林、双黄连。

论文目录:

内容提要

摘要

Abstract

前言

第一部分文献综述

综述一牛病毒性腹泻病的研究概况

1 牛病毒性腹泻病病原学

1.1 牛病毒性腹泻病毒分类位置

1.2 牛病毒性腹泻病毒的形态和理化特性

1.3 牛病毒性腹泻病毒基因组结构及功能

1.3.1 5′端非编码区

1.3.2 开放阅读框架区

1.3.3 3′端非翻译区

1.4 牛病毒性腹泻病毒基因组编码蛋白的结构及功能

1.4.1 N~(pro)

1.4.2 E_0

1.4.3 E_0

1.4.4 E_1

1.4.5 E_2

1.4.6 P_7

1.4.7 NS_(2-3)

1.4.8 NS_(4A)(P_(10))、NS_(4B)(P_(32))、NS_(5A)(P_(58))、NS_(5B)(P_(75))

2 牛病毒性腹泻病流行病学

2.1 牛病毒性腹泻病流行趋势和特点

2.2 牛病毒性腹泻病传染源、易感动物和传播途径

2.2.1 牛病毒性腹泻病传染源

2.2.2 牛病毒性腹泻病易感动物

2.2.3 牛病毒性腹泻病传播途径

2.3 牛病毒性腹泻病毒流行株的基因型分析

2.3.1 牛病毒性腹泻病毒国外流行株基因型

2.3.2 牛病毒性腹泻病毒我国流行株基因型

2.4 牛病毒性腹泻病流行原因

2.4.1 牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒交叉感染

2.4.2 牛病毒性腹泻病毒基因型的多样性

2.4.3 牛病毒性腹泻病毒持续性感染

3 牛病毒性腹泻病临床类型

3.1 病毒性腹泻

3.2 持续性感染与免疫耐受

3.3 粘膜病

3.4 繁殖力下降

3.5 血小板减少和出血性综合症

4 牛病毒性腹泻病诊断技术

4.1 血清学中和实验

4.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)

4.3 分子生物学诊断技术

4.3.1 分子生物学诊断的基因区域

4.3.2 核酸杂交(NAH)技术

4.3.3 反转录—多聚酶链式反应(RT-PCR)技术

4.3.4 复合PCR诊断BVDV和HCV技术

5 牛病毒性腹泻病毒NCP型向CP型转化机制

5.1 外源序列的插入

5.2 自身的基因发生了重排和拷贝

5.3 外源细胞序列插入的同时伴有病毒基因的复制

5.4 缺陷干扰粒子(defectiveinterference，DI)

5.5 点突变

6 牛病毒性腹泻病的综合防制

6.1 疫苗防制

6.1.1 灭活苗

6.1.2 弱毒苗

6.1.3 基因工程苗

6.2 药物防制

6.2.1 利巴韦林

6.2.2 芳香族阳离子化合物

6.2.3 复合物1453

6.2.4 干扰素

6.2.5 中药

综述二基因免疫的研究概况

1 基因疫苗免疫机制

2 基因疫苗的组成

3 基因疫苗的特点

4 影响基因免疫效果的因素

4.1 载体质粒的影响

4.2 基因疫苗的免疫方法及途径影响

4.3 接种剂量、次数、容积及质粒质量的影响

4.4 保护性抗原基因及其所编码抗原结构的影响

4.5 基因疫苗质粒的高效导入的影响

4.6 基因疫苗免疫佐剂的影响

4.6.1 核酸质粒的免疫佐剂影响

4.6.2 细胞因子基因的影响

4.6.3 趋化因子和共刺激分子基因的影响

4.6.4 基因佐剂联合应用的影响

4.6.5 抗原靶向作用的影响

第二部分实验研究

实验一梅花鹿源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.2 病毒的分离培养和浓缩

1.3 病毒理化特性测定和病毒中和试验

1.3.1 病毒的毒力测定

1.3.2 病毒的理化学鉴定

1.3.3 中和试验鉴定

1.4 电镜负染观察

1.5 特异性引物设计与合成

1.6 病毒细胞培养物总RNA提取

1.7 反转录

1.8 PCR扩增

2 结果与分析

2.1 病毒的分离培养法鉴定结果

2.2 病毒理化特性测定结果

2.2.1 病毒的毒力测定结果

2.2.2 病毒的理化学鉴定结果

2.3 病毒中和试验结果

2.4 电镜负染观察鉴定结果

2.5 RT-PCR扩增鉴定结果

3 讨论

3.1 关于梅花鹿感染BVDV的来源

4 小结

实验二梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区的克隆与分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 病毒培养和浓缩

1.3 RNA的提取及鉴定

1.4 引物的设计

1.5 反转录

1.6 PCR扩增

1.7 CDNA片段的克隆与鉴定

1.8 序列分析

2 结果

2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增鉴定结果

2.2 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒PCR鉴定结果

2.3 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区重组pMD18-T／NS_(2-3)克隆质粒酶切鉴定结果

2.4 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区测序结果

2.5 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区核苷酸序列分析结果

2.6 梅花鹿源BVDV分离株NS_(2-3)基因重要区氨基酸序列分析结果

3 讨论

3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株致细胞病变机制

3.2 关于梅花鹿感染BVDV原因

3.3 关于梅花鹿BVDV分离株基因型

4 小结

实验三梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 病毒培养和浓缩

1.2.2 RNA的提取

1.2.3 引物的设计

1.2.4 反转录

1.2.5 PCR扩增

1.2.6 cDNA片段的克隆与鉴定

1.2.7 序列分析

2 结果

2.1 梅花鹿源BVDV分离株RT-PCR扩增结果

2.2 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒PCR鉴定结果

2.3 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因重组pMD18-T／E_0克隆质粒酶切鉴定结果

2.4 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因测序结果

2.5 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因序列同源性及系统进化树分析结果

2.6 梅花鹿源BVDV分离株E_0基因推导的氨基酸序列及同源性分析结果

2.7 梅花鹿源BVDV分离株E_0蛋白特性的预测及与其他瘟病毒毒株比较分析结果

3 讨论

3.1 关于梅花鹿源BVDV分离株基因型

3.2 关于梅花鹿和牛之问BVDV传播

3.3 关于用E_0基因核苷酸序列做BVDV基因分型依据

3.4 关于BVDV和猪瘟疫苗

3.5 关于E_0蛋白

4 小结

实验四梅花鹿源BVDV分离株E_0基因原核表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酶、抗体及Marker

1.1.2 质粒和表达菌种

1.1.3 质粒的小量提取试剂

1.1.4 诱导表达试剂

1.1.5 SDS-PAGE试剂

1.1.6 Western-blotting试剂

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pET-28a／E_0的构建

1.2.2 重组质粒pET-28a／E_0鉴定

1.2.3 诱导表达

1.2.4 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.2.5 westernb1otting分析

2 结果

2.1 回收E_0基因片段结果

2.2 原核表达pET28a空载体电泳结果

2.3 原核表达载体与外源片段的定量比较结果

2.4 梅花鹿分离株E_0基因重组pET28a／E_0质粒的初选结

2.5 重组原核表达质粒PCR鉴定结果

2.6 重组原核表达质粒酶切鉴定结果

2.7 E_0基因表达产物SDS-PAGE的检测结果

2.8 E_0基因表达产物Western-blotting的检测结果

3 讨论

3.1 关于基因在大肠杆菌中的高效表达

4 小结

实验五梅花鹿源BVDV分离株E_0基因的真核表达

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 DNA酶切、连接、反转录、PCR及回收试剂

1.1.2 质粒大量提取的试剂

1.1.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞材料及病毒株

1.1.4 ELISA法检测试剂

1.2 方法

1.2.1 重组真核表达质粒pVAX1／E_0的构建

1.2.2 真核表达工程菌pVAX1／E_0重组质粒的鉴定

1.2.3 真核表达质粒pVAX1／E_0转染BHK-21细胞

1.2.4 真核表达质粒pVAX1／E_0在真核细胞中表达的检测

2 结果

2.1 真核表达质粒pVAX1转化工程菌的结果

2.2 pVAX1／E_0真核表达重组质粒PCR鉴定结果

2.3 pVAX1／E_0真核表达载体酶切鉴定结果

2.4 pVAX1／E_0大提质粒结果

2.5 RT-PCR法检测pVAX1／E_0在真核细胞中转录结果

2.6 间接ELISA法检测pVAX1／E_0在真核细胞中表达的结果

3 讨论

3.1 关于真核表达载体

3.2 关于基因疫苗质粒的高效导入

4 小结

实验六梅花鹿源BVDV分离株基因苗的动物免疫试验

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体质粒

1.1.2 免疫学试剂

1.1.3 实验动物

1.1.4 质粒的大量提取试剂

1.1.5 ELISA法检测试剂

1.1.6 兔的淋巴细胞转化实验试剂与材料

1.2 方法

1.2.1 基因苗、灭活苗的制备

1.2.2 兔的分组及各种疫苗的免疫剂量和次数

1.2.3 各种疫苗免疫家兔的抗体检测

1.2.4 T淋巴细胞转化实验

1.2.5 B淋巴细胞转化实验

1.2.6 统计分析

2 结果

2.1 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗免疫家兔的抗体检测比较结果

2.2 梅花鹿源BVDV基因苗与灭活苗对家兔淋巴细胞增殖(A_(570))影响的结果

3 讨论

3.1 关于基因苗的优点

4 小结

实验七梅花鹿源BVDV分离株敏感药物筛选的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

1.1.2 MDBK细胞和BVDV病毒

1.1.3 主要化学试剂

1.1.4 试剂

1.1.5 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 药物安全浓度测试试验

1.2.2 敏感药物筛选试验和MDBK单层细胞制备

2 结果

2.1 试验药物对MDBK细胞贴壁影响的结果

2.2 试验药物对MDBK细胞单层影响的结果

2.3 试验药物在MDBK细胞上最大安全浓度确定结果

2.4 先加药后加病毒方式药物抗BVDV效果比较结果

2.5 先加病毒后加药方式药物抗BVDV效果比较结果

2.6 药和病毒同时加方式药物抗BVDV效果比较结果

2.7 药物抗BVDV抑制率比较结果

3 讨论

3.1 关于中性红染料吸收法

3.2 关于药物对组织细胞的毒性

3.3 关于药物抗病毒作用量效关系

3.4 关于抗病毒的药物

4 小结

结论

参考文献

致谢

导师简介

作者简介

发布时间: 2006-01-04

参考文献

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鹿源BVDV分离鉴定、E0基因的克隆与表达及免疫原性研究

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