论文摘要
当前,AIDS对人类的生存和发展提出了严峻的挑战,已成为全球面临的严重公共卫生问题和社会问题。目前针对AIDS的高效抗逆转录病毒疗法（highly active anti-retroviral therapy, HAART）,临床作用显示可以明显减少AIDS相关发病率和死亡率。HAART主要使用一种HIV-1蛋白酶（Protease, PR）抑制剂（HIV-1 Protease inhibitor, PI）药物结合两种HIV反转录酶抑制剂药物治疗。由于HIV逆转录酶易发生复制错误使得感染人群中的HIV基因序列差异很大,以及抗HIV药物的广泛应用导致HIV的耐药突变株不断出现,影响治疗效果。因而迫切要求更多﹑更新的抗HIV药物以对抗不同序列的HIV和不断出现的HIV耐药突变株。目前常用的PI类药物筛选模型其原理如下:在HIV PR对其靶序列切割作用时,加入待筛药物并检测其对于切割的抑制作用,从而鉴定该待筛药物的实际应用。然而,由于HIV PR对不同的靶序列具有不同的切割活性,针对不同的耐药突变PR,需要选择与之适应的PR靶位点来进行筛选,而目前出现的各种耐药突变PR,其最适应的PR靶序列尚未明确,因而现有方法难以应对各种耐药突变PR进行有效的PI类药物筛选。因此对抗HIV药物的体外筛选模型提出了更高的要求:迅速建立新的﹑针对不同序列HIV及耐药突变HIV的体外药物筛选模型,使之既与现有的模型相互补充,又能提高抗HIV药物的筛选效率。我们的设想是应用噬菌体展示技术,构建展示HIV蛋白酶PR靶序列随机突变的噬菌体文库,从中筛选出对耐药突变PR高敏感性的PR靶序列,从而应用于针对耐药突变PR的PI类药物筛选。同时,利用展示耐药突变PR敏感的PR靶序列的噬菌体,结合耐药突变PR,可以直接针对耐药突变PR进行PI类药物筛选。本研究在HIV PR的靶序列CAP2和NC之间的切割位点部分进行了随机化,将随机化序列展示在噬菌体载体上,构建噬菌体展示文库。用HIV PR对噬菌体展示文库进行切割筛选。本研究分以下三个部分进行:一.HIV-1型HXB2株PR在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定根据HIV-1 HXB2株PR及CAP2NC DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PR的DNA编码序列,并在PR序列上游添加自切割位点GTVSFNF7个氨基酸的编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体进行测序。将PR DNA克隆至原核表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL-21 DE3诱导表达,表达出相对分子质量为30 000的HIV-1 PR融合蛋白。用Ni-NTA亲和柱对表达蛋白进行纯化,纯化的目的蛋白浓度为2.54mg/ml。将纯化的PR蛋白与复性缓冲液进行1:20比例混合进行稀释复性。此部分工作由本研究合作者第二军医大学陈铭硕士完成。二.HIV-1蛋白酶靶位点CAP2NC序列的随机化文库的构建借助噬菌体载体,构建适合筛选用的大容量突变体文库是进行体外分子进化研究的重要部分。我们对PR靶序列区域的随机突变设计为:应用含有随机核苷酸序列的引物,使用重叠延伸PCR（overlapping PCR）的方法,将HIV PR作用的靶序列CAP2和NC之间引入随机突变。为了能更好的研究突变靶序列和增大PR靶序列中被筛选的氨基酸范围,我们分别随机化了三组不同的氨基酸,将其连接于自主构建的噬菌体载体pCANTAB5S-F7上,构建了三个噬菌体展示文库。所得到的三个原代噬菌体文库,库容量分别为9.7×106﹑6.3×106﹑1.2×107;噬菌体文库滴度均达1013TU/ml数量级;PCR鉴定为阳性克隆的阳性插入率分别占50%﹑62.5%﹑41.67%;重组质粒的双酶消化可以得到大小正确的目的片段;测序分析表明切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸随机分布均匀;各文库中有60%以上的单克隆噬菌体与IgG有良好的结合活性。文库在库容量、多样性、随机性及IgG结合活性评价良好,满足后续体外HIV蛋白酶切割筛选的要求。三.HIV-1 PR对蛋白酶靶位点CAP2NC序列的随机化文库的筛选模型和切割筛选噬菌体载体pCANTAB5S-F7是第二军医大学微生物教研室在关于免疫球蛋白结合分子的体外分子进化的研究中筛选得到的一种与IgG结合活性很好的噬菌体载体。我们将人IgG包被在ELISA酶标板中,可以有效吸引结合噬菌体,将其固相化于ELISA酶标板上。加入HIV SF2 PR进行切割筛选,以期获得对PR敏感的PR靶序列。但前期筛选并未收取到良好的成效。实验中加入了验证HIV-1 PR的切割活性的部分。我们制备出展示有PR原靶位点（即未经过突变改造的）CAP2NC序列的噬菌体pCANTAB5S-F7-CAP2NC,和不展示任何序列的空载体pCANTAB5S-F7分别按照1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000的比例混和后,加入HIV SF2 PR进行切割作用,HIV SF2 PR作用的灵敏度可达1:1000的混和浓度。在这个灵敏度,一次酶切筛选即能将阳性噬菌体检出,证明了HIV SF2 PR能够有效的切割固相化在酶标板上的展示于噬菌体表面的HIV PR靶序列,并且能被有效检测。证实了我们利用HIV SF2 PR能够对PR靶序列随机突变文库进行切割筛选以获得PR敏感的PR靶序列的可行性之后,在后续筛选中,对NC段缺失的噬菌体展示文库的筛选得到了一些对HIV SF2 PR较敏感的序列,后续研究仍在进行中。本研究成功对HIV-1 PR靶蛋白CAP2NC间的酶作用位点进行了随机化,并构建了展示包含有随机突变序列的噬菌体文库,文库的库容量、多样性、随机性及IgG结合活性评价良好,满足后续体外HIV蛋白酶切割筛选的要求。在第二部分的筛选工作中,证实了HIV SF2 PR能够有效的切割固相化于酶标板上的展示噬菌体表面的HIV PR靶序列,并在突变体文库中筛选得到一些对HIV SF2 PR较为敏感的序列结构。本研究为目前所使用的PI类药物体外筛选模型提供了一种新的思路和方法,也为酶与底物相互作用的研究提供了一个新平台。