神经节苷脂对神经细胞脂多糖损伤保护作用机制的研究

论文摘要

目的建立PC12细胞脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）损伤模型和原代神经元细胞LPS损伤模型,并利用这两种模型探讨神经节苷脂（ganglioside, GM1）和神经生长因子（nerve growth factor, NGF）分别对LPS损伤的再修复作用,以及两者联合使用对细胞LPS损伤的保护作用及其作用机制,是否与核转录因子（Nuclear factor kBNF-KB）激活有关。方法（1）PC12细胞LPS损伤模型以及原代神经元细胞LPS损伤模型的建立：PC12细胞常规培养后,加入不同浓度的LPS对PC12细胞进行损伤,24h后通过MTT法测定细胞存活率,以确定最佳损伤浓度；取新生SD乳鼠大脑皮层,分离出原代神经元细胞进行培养,培养成熟后,加入不同浓度的LPS对原代神经元细胞进行损伤,24h后通过MTT法测定细胞存活率,考察是否具有损伤,且确定最佳损伤浓度,确定损伤模型；（2）损伤保护作用实验：确定损伤浓度后,对PC12细胞以及原代神经元细胞进行损伤的同时加入不同浓度GM1、NGF以及两者联用,通过形态学上的观察,MTT法测定细胞存活率以及荧光双重染色,来明确药物治疗是否具有保护作用,同时确定药物治疗的最佳浓度,最后通过细胞收集,RT-PCR分析细胞中NF-KB的相对含量的变化。另外,加入神经鞘糖脂生物合成抑制剂（D-PDMP）抑制细胞中内源性神经节苷脂后,再以同样的方法进行实验观察,分析内源性神经节苷脂的药理作用,试明确GM1和NGF对细胞LPS损伤的保护作用及其作用机制,是否与NF-KB激活有关。结果（1）通过实验发现PC12细胞以及原代神经元细胞对LPS损伤具有一定的浓度依赖性,选定LPS浓度为100nmol/L作为损伤模型。（2）通过形态学上和荧光双重染色的观察以及MTT、RT-PCR的分析,PC12细胞模型的结果显示GMl以及NGF对细胞LPS损伤具有保护作用,可能是通过抑制NF-KB信号通路活化而起到保护作用。另外,用D-PDMP抑制内源性神经节苷脂,加入外源性神经节苷脂后,损伤模型具有同样的效果；同样地,原代神经元细胞损伤模型的结果与PC12细胞细胞损伤模型相似。结论神经节苷脂GM1以及神经生长因子NGF对PC12细胞以及原代神经元细胞的LPS损伤具有保护作用,且对PC12细胞以及原代神经元细胞损伤后再恢复有促进作用,主要表现在促进神经细胞突起生长和神经细胞功能恢复,并且其作用机制可能与NF-KB信号通路的激活有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 神经节苷脂GM1概述
• 1.3 NF-KB信号通路在中枢神经系统疾病中的研究
• 1.3.1 NF-KB概述
• 1.3.2 NF-KB信号通路
• 1.3.3 NF-KB在阿尔茨海默病中的作用
• 1.3.4 NF-KB在脑缺血中的作用
• 1.3.5 NF-KB在中枢神经系统炎症的作用
• 1.3.6 NF-KB信号通路调控与治疗策略
• 1.4 细胞模型
• 1.4.1 PC12细胞模型
• 1.4.2 原代神经元细胞模型
• 1.4.3 细胞损伤模型的建立
• 1.5 本实验内容和创新点
• 第二章 GM1对PC12细胞LPS损伤保护作用及其机制
• 2.1 外源性神经切苷脂对PC12细胞LPS损伤的保护作用
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 试剂材料
• 2.1.1.2 实验设备
• 2.1.1.3 实验试剂配制
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 细胞培养
• 2.1.2.2 MTT细胞存活率检测
• 2.1.2.3 不同浓度的神经节苷脂GM1对PC12细胞的作用
• 2.1.2.4 PC12细胞LPS损伤模型的建立
• 2.1.2.5 神经节苷脂GM1对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 2.1.2.6 神经节苷脂GM1联合NGF对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 2.1.2.7 形态学观察PC12细胞状态
• 2.1.2.8 荧光双重染色观察
• 2.1.2.9 RT-PCR检测NF-κB相对表达含量
• 2.1.2.10 统计方法
• 2.1.3 实验结果
• 2.1.3.1 不同浓度的神经节苷脂GM1对PC12细胞的作用
• 2.1.3.2 PC12细胞LPS损伤模型的建立
• 2.1.3.3 神经节苷脂GM1对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 2.1.3.4 神经节苷脂GM1联合NGF对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 2.1.3.5 形态学观察PC12细胞状态
• 2.1.3.6 荧光双重染色观察
• 2.1.3.7 RT-PCR检测NF-κB相对表达含量
• 2.1.4 讨论
• 2.2 内源性神经节苷脂对PC12细胞LPS损伤的保护作用
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 不同浓度D-PDMP本身对PC12细胞的毒性实验
• 2.2.2.2 内源性神经节苷脂对PC12细胞损伤的保护作用
• 2.2.2.3 倒置显微镜下观察PC12细胞的形态
• 2.2.2.4 荧光双重染色观察细胞状态
• 2.2.2.5 RT-PCR检测NF-KB相对表达含量
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.3.1 不同浓度D-PDMP本身对PC12细胞的毒性实验
• 2.2.3.2 内源性神经节苷脂对PC12细胞损伤的保护作用
• 2.2.3.3 倒置显微镜下观察PC12细胞的形态
• 2.2.3.4 荧光双重染色观察细胞状态
• 2.2.3.5 RT-PCR检测NF-KB相对表达含量
• 2.2.4 讨论
• 第三章 GM1对原代神经元细胞LPS损伤保护作用及其机制
• 3.1 外源性神经节苷脂对原代神经元细胞LPS损伤的保护作用
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 试剂材料
• 3.1.1.2 实验试剂配制
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 实验结果
• 3.1.3.1 不同浓度的神经节苷脂GM1对原代神经元细胞的作用
• 3.1.3.2 不同浓度的神经节苷脂GM1对原代神经元细胞的作用
• 3.1.3.3 原代神经元细胞损伤模型的建立
• 3.1.3.4 神经节苷脂GM1对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 3.1.3.5 神经节苷脂GM1联合NGF对脂多糖（LPS）损伤的保护作用
• 3.1.3.6 形态学观察原代神经元细胞状态
• 3.1.3.7 荧光双重染色观察
• 3.1.3.8 RT-PCR测定NF-KB的相对含量
• 3.1.4 讨论
• 3.2 内源性神经节苷脂对原代神经元细胞LPS损伤的保护作用
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 实验结果
• 3.2.3.1 不同浓度的神经切苷脂GM1对原代神经元细胞的作用
• 3.2.3.2 内源性神经节苷脂对原代神经元细胞损伤的保护作用
• 3.2.3.3 倒置显微镜下观察原代神经元细胞的形态
• 3.2.3.4 荧光双重染色观察细胞状态
• 3.2.3.5 RT-PCR检测NF-KB相对表达含量
• 3.2.4 讨论
• 第四章 NF-KB抑制剂对LPS损伤的作用
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 第五章 总结、创新与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录