转正、反义磷脂酶Dα基因和Bt毒蛋白基因毛白杨的获得及其抗性分析

论文摘要

植物生长发育经常遇到的逆境以干旱、盐碱、虫害等最为严重,在干旱、盐碱等逆境胁迫下会导致植物的渗透胁迫和氧化胁迫伤害,使植物细胞膜的结构和功能遭到破坏,以致光合作用和信号转导作用大大降低。如果通过基因工程的手段将植物细胞膜上起到重要信号传递作用的磷脂酶Dα(Phospholipase Dα,PLDα)基因导入植物,发挥抗氧化、渗透调节功能,将能有效的提高植物抗旱、耐盐等抗逆能力。毛白杨是我国特有的乡土树种,是我国北方地区重要的造林和平原绿化树种。随着杨树人工林面积的不断扩大,虫害问题越来越突出,危害严重,利用基因工程技术培育抗虫杨树新树种,是防治害虫的有效手段。本研究将正、反义PLDα基因分别转入毛白杨,进行了基因功能的鉴定。在此基础上,选取超表达PLDα基因耐盐、抗旱性较强的毛白杨优良株系,导入具有抗虫功能的Bt毒蛋白基因,培育获得了既耐盐、抗旱又抗虫的多抗毛白杨新品种。转基因植株的获得为探讨植物抗逆的生理和分子机制以及抗性转基因杨树的实际应用打下良好的基础。主要实验结果如下:1.正、反义PLDα基因转化毛白杨及基因功能的鉴定(1)利用农杆菌介导的叶圆盘转化法分别将正、反义PLDα基因转入毛白杨。在含有卡那霉素的培养基上筛选,获得转正义PLDα基因的抗性植株45个株系,转反义PLDα基因的抗性植株49个株系。(2)微量提取植物总DNA进行PCR检测,结果显示,在含有卡那霉素培养基上筛选的抗性植株(除转反义基因1株外)均扩增出约780bp大小的目的带,初步证明卡那霉素抗性植株为转基因植株。(3)大量提取转正、反义PLDα基因植株的总DNA分别用限制型内切酶XbaI和BamHI酶切,Southern blot分析结果显示,PCR检测结果呈阳性的毛白杨植株均检测到信号,证明目的基因已经整合到杨树的染色体中,并且有1～5个拷贝数。(4)Northern blot分析结果显示,各转正义PLDα基因植株均检测到明显的杂交信号,转反义PLDα基因植株杂交信号弱于野生型,表明正义PLDα基因在转录水平进行了有效的超表达,反义基因抑制了植物内源PLDα基因的表达。(5)试管苗的耐盐抗旱性实验表明,在含有不同浓度的NaCl(0,68,102,136,172mmol/L)和甘露醇(0,150,200,250,300mmol/L)的培养基上,转正义PLDα基因杨树的生根率和平均根长都明显高于野生型和转反义PLDα基因的植株,表明转正义PLDα基因杨树的耐盐、抗旱能力较强。(6)干旱或盐胁迫处理条件下,不同转基因植株的Northern blot分析结果显示:经过干旱或盐胁迫处理的野生型和转正义PLDα基因植株的信号都强于正常浇水的植株;在正常浇水的转反义PLDα基因植株中检测不到信号,而干旱或盐处理植株中都检测到信号。表明干旱或盐胁迫可以诱导植物PLDα基因的表达,或者使PLDα基因的表达量有不同程度的提高,也说明转反义PLDα基因并没有完全抑制内源PLDα的转录。(7)在20% PEG6000模拟干旱条件下,转正义PLDα基因杨树的质膜损伤程度小于野生型,而转反义PLDα基因杨树的质膜损伤程度大于野生型;同时在200mmol/L NaCl模拟盐害条件下,也得出了类似上述结果。表明转正义PLDα基因提高了植物的抗旱和耐盐性,而转反义PLDα基因反而降低了植物的耐盐、抗旱能力。(8)杨树叶片细胞形态学分析得知,正常条件下细胞膜系统完整,细胞膜,线粒体膜,叶绿体膜,叶绿体基粒片层等膜系统和结构都比较规则。经过200mmol/LNaCl或20%PEG6000处理以后,转基因和野生型植株细胞膜系统都有不同程度的破坏;野生型植株细胞膜受到破坏,叶绿体变圆,外膜受到损伤,线粒体破坏严重,膜不完整;转正义PLDα基因植株细胞受到的破坏较轻,线粒体外膜有点损伤,细胞膜、叶绿体膜和液泡膜还比较完整;而转反义PLDα基因植株细胞膜系统破坏最严重,叶绿体变圆,基粒片层错乱,叶绿体外膜、细胞膜和液泡膜都受到严重的损伤。由此推测,转正义PLDα基因植株中PLDα基因的超表达,对渗透胁迫条件下植物细胞膜系统有保护作用。2.耐盐、抗旱、抗虫多抗转基因毛白杨的获得(1)构建了包含Bt毒蛋白基因的植物表达载体pBT1946,内含有抗除草剂(bar)基因,作为选择性标记基因。叶片分化实验确定适宜的筛选压力为PPT浓度0.4mg/L。(2)选取具有较强耐盐、抗旱能力的转正义PLDα基因毛白杨9号株系(S9)作为受体材料,利用农杆菌介导法导入Bt毒蛋白基因(cry1Ab),在含有除草剂(PPT)的培养基上筛选获得70个抗性株系。(3)微量提取植物总DNA进行PCR检测,结果显示,在含有除草剂培养基上筛选获得的抗性植株,有50个株系扩增出约500bp大小的目的带,初步表明外源基因已整合到这些植株的染色体基因组中。(4)大量提取转Bt毒蛋白基因植株的总DNA,用限制型内切酶HindⅢ酶切。Southern blot分析结果显示,PCR检测结果呈阳性的毛白杨植株均检测到信号,证明目的基因已经整合到毛白杨S9的染色体中,并且存在1～5个拷贝数。(5)Northern blot分析结果显示,各转基因植株均检测到明显的杂交信号,而非转基因植株无任何杂交信号,表明Bt毒蛋白(cry1Ab)基因在转录水平得到了有效表达。(6)ELISA检测结果表明,Bt毒蛋白基因在翻译水平进行有效的表达,植物中Bt蛋白的含量为725.11ng/g～866.43ng/g。(7)饲虫实验结果表明,盆栽苗幼嫩叶片饲喂舞毒蛾幼虫30d后,各个转基因株系幼虫死亡率均在90%以上,最高达到98.9%;而非转基因植株幼虫死亡率仅为10%。证明转Bt毒蛋白基因杨树具有较强的抗虫能力。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 植物耐非生物胁迫研究进展
• 1.1.1 植物抗旱性
• 1.1.1.1 植物抗旱性机制
• 1.1.1.2 编码植物抗旱关键基因的克隆
• 1.1.1.3 抗逆相关的转录因子及双组分系统基因
• 1.1.2 植物的耐盐性
• 1.1.2.1 植物在组织器官水平上的耐盐机制
• 1.1.2.2 植物在分子细胞水平的耐盐机制
• 1.1.3 植物的抗氧化性
• 1.1.3.1 植物中的活性氧产生及清除
• 1.1.3.2 活性氧的酶促脱毒系统
• 1.1.3.3 活性氧的非酶促清除及相关分子
• 1.2 磷脂酶D 及其与植物耐受逆境胁迫
• 1.2.1 磷脂酶D （PLD）基因的克隆
• 1.2.2 PLD 的特性及其在信号转导和细胞生命活动中的作用
• 1.2.3 PLD 功能的特异性
• 1.2.4 PLD 基因在植物育种上的应用
• 1.2.4.1 在法国梧桐中的利用
• 1.2.4.2 在抗黄曲霉毒素花生中的利用
• 1.2.4.3 在耐盐杨树中的利用
• 1.3 植物抗虫基因工程研究进展
• 1.3.1 常用的抗虫基因
• 1.3.1.1 植物来源的抗虫基因
• 1.3.1.2 非植物来源的抗虫基因
• 1.4 抗虫转基因杨树研究进展及前景
• 1.4.1 转Bt 基因杨树
• 1.4.2 转蛋白酶抑制剂基因杨树
• 1.4.3 转昆虫特异性神经蝎毒素基因杨树
• 1.4.4 转双价抗虫基因杨树
• 1.5 立项依据及目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、菌株、质粒、酶、试剂和仪器
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 酶和试剂
• 2.1.4 试验所用仪器
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 杨树组织培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA 的微量提取（煮沸法）
• 2.2.2 质粒DNA 的大量提取（碱裂解法）
• 2.2.3 DNA 片段的回收
• 2.2.4 质粒DNA与目的片段DNA的连接
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6 质粒DNA 向大肠杆菌中转化（热激法）
• 2.2.7 转化菌落PCR鉴定
• 2.2.8 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的制备
• 2.2.9 植物表达载体向农杆菌转化（冻融法）
• 2.2.10 选择压力的确定
• 2.2.11 农杆菌介导的杨树基因转化
• 2.2.11.1 农杆菌培养
• 2.2.11.2 农杆菌侵染法转化杨树
• 2.2.11.3 转化植株扩繁和移栽
• 2.2.12 毛白杨再生苗的PCR 检测
• 2.2.12.1 植物总DNA 的微量提取（CTAB 法）
• 2.2.12.2 PCR 扩增
• 2.2.13 植物总DNA 的提取及Southern blot 分析
• 2.2.13.1 植物总DNA 的提取（SDS 法）
• 2.2.13.2 DNA 凝胶电泳
• 2.2.13.3 转膜（DNA 碱转移）
• 2.2.13.4 探针的制备
• 2.2.13.5 杂交
• 2.2.14 植物总RNA 的提取及Northern blot 分析
• 2.2.14.1 RNA 提取（TRIZOL 试剂盒）
• 2.2.14.2 RNA 甲醛变性凝胶电泳
• 2.2.15 转膜及固定
• 2.2.15.1 探针制备及杂交（同Southern 杂交分析）
• 2.2.16 转基因植株试管苗的耐盐抗旱性实验
• 2.2.17 转基因植株的RNA 表达与渗透胁迫的关系
• 2.2.18 转基因植株在逆境处理下生理指标的测定
• 2.2.18.1 转基因植株的逆境处理
• 2.2.18.2 转基因杨树抗氧化酶活性测定
• 2.2.18.3 叶绿素a 荧光动力学参数的测定
• 2.2.18.4 光合气体交换参数的测定
• 2.2.18.5 质膜透性的测定
• 2.2.18.6 叶绿素含量的测定
• 2.2.19 转基因杨树在逆境条件下细胞形态学分析
• 2.2.20 ELISA检测
• 2.2.21 植株抗虫性测试
• 3 结果与分析
• 3.1 转正、反义磷脂酶Dα基因毛白杨的获得及功能鉴定
• 3.1.1 植物表达载体向农杆菌转化
• 3.1.2 转基因植株的获得
• 3.1.3 转基因植株的PCR 检测
• 3.1.4 转基因植株的Southern blot 检测
• 3.1.5 转基因植株的Northern blot 检测
• 3.1.6 试管苗的耐盐、抗旱性实验
• 3.1.7 转基因植株PLDα的表达量与渗透胁迫关系
• 3.1.8 盆栽苗耐盐抗旱性分析
• 3.1.8.1 在NaCl 处理条件下转基因植株的生长状况
• 3.1.8.2 NaCl 处理对不同转基因植株质膜透性的影响
• 3.1.8.3 NaCl 处理对不同转基因植株光合速率的影响
• 3.1.8.4 NaCl 处理对不同转基因植株荧光动力学的影响
• 6000处理条件下的生长情况'>3.1.8.5 转基因植株在PEG₆₀₀₀处理条件下的生长情况
• 6000 处理对不同转基因植株质膜透性的影响'>3.1.8.6 PEG₆₀₀₀处理对不同转基因植株质膜透性的影响
• 6000 处理对不同转基因植株光合速率的影响'>3.1.8.7 PEG₆₀₀₀处理对不同转基因植株光合速率的影响
• 6000 处理对不同转基因植株荧光动力学的影响'>3.1.8.8 PEG₆₀₀₀处理对不同转基因植株荧光动力学的影响
• 3.1.8.9 渗透胁迫对转基因植株叶绿素含量的影响
• 3.1.8.10 渗透胁迫对转基因植株抗氧化酶活性的影响
• 3.1.8.11 渗透胁迫对转基因植株丙二醛含量的影响
• 3.1.8.12 渗透胁迫对转基因植株可溶性蛋白含量的影响
• 3.1.9 转基因杨树细胞形态学分析
• 3.1.9.1 NaCl 处理对转基因杨树细胞膜系统的影响
• 6000 模拟干旱处理对转基因杨树细胞膜系统的影响'>3.1.9.2 PEG₆₀₀₀模拟干旱处理对转基因杨树细胞膜系统的影响
• 3.2 耐盐、抗旱、抗虫多抗转基因杨树的获得
• 3.2.1 含Bt基因的植物表达载体的构建
• 3.2.2 植物表达载体质粒导入农杆菌
• 3.2.3 筛选压力的确定
• 3.2.4 转基因植株的获得
• 3.2.5 转基因植株的PCR 检测
• 3.2.6 转基因植株的Southern blot 检测
• 3.2.7 转基因植株的Northern blot 检测
• 3.2.8 Bt蛋白含量的ELISA检测
• 3.2.8.1 由标准蛋白梯度对应的检测的OD 值作出回归直线
• 3.2.8.2 抗虫转基因杨树不同株系Bt 蛋白的含量
• 3.2.9 转基因植株抗虫性测试
• 4 讨论
• 4.1 本研究的创新性
• 4.2 PLD 介导抗逆性机理
• 4.3 多抗毛白杨植株的获得
• 4.4 单基因分步转移的可行性
• 4.5 转基因杨树生态安全性
• 4.6 存在问题与展望
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ常用缓冲液及培养基的配制
• 附录Ⅱ常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器
• 附录Ⅲ质粒图谱
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况