鸭源大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌原生质体融合及其融合子研究

论文摘要

临床上,鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌常以混合感染的形式出现,死亡率高,淘汰率高,给养鸭业造成极大的经济损失,目前常采用二联苗对二者进行免疫预防。本试验为得到鸭源大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌的融合菌株,首先通过药敏试验和血清型鉴定试验,筛选出一株对庆大霉素敏感、红霉素耐药、血清型为O78的鸭源大肠杆菌ZYD2，以及一株对红霉素敏感、庆大霉素耐药的鸭疫里默氏杆菌YL1,用于原生质体融合；并通过活菌计数法绘制YL1和ZYD2的生长曲线,确定YL1原生质体制备时间在7h左右,ZYD2原生质体制备时间在5h左右；同时通过对YL1和ZYD2的最低抑菌浓度（MIC）测定,确定高渗选择性再生培养基的抗生素浓度为红霉素20μg/mL,庆大霉素20μg/mL。筛选出的亲本菌株,首先采用Lysozyme-EDTA法制备原生质体；再通过PEG法进行原生质体融合；最后利用抗药性初次筛选融合菌株,再通过凝集实验、培养特性鉴定、菌落形态鉴定、染色特性鉴定、稳定性检测复筛,得到64株具有两亲本菌株抗原特性、性状可稳定遗传的融合菌株,并通过生化鉴定筛选出4株生化特性、培养特性、染色特性、菌落形态均介于YL1和ZYD2之间的典型融合菌株。制备原生质体时,为提高原生质体制备率,对YL1和ZYD2原生质体制备的溶菌酶浓度和作用时间进行选择,确定在本试验条件下YL1原生质体制备所用溶菌酶浓度为0.1 mg/mL,作用时间为20 min; ZYD2原生质体制备所用溶菌酶浓度为0.2 mg/mL,作用时间为20mm。为研制鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌融合菌株二联苗,本试验对典型融合菌株进行了研究,发现4株典型融合菌株生化特性、培养特性、染色特性、菌落形态在冷冻保存、多次传代后均未发生改变,同时具备亲本菌株双重耐药性和抗原特性。攻毒试验结果表明典型融合菌株半数致死量比两亲本菌株高,毒性减弱（DL4、DL5、DL8、DL29的半数致死量分别依次为2.8×108 CFU/mL、1.7×108 CFU/mL、1.0×109 CFU/mL、4.4×109 CFU/mL, ZYD2的半数致死量为1.5×107 CFU/mL, YL1的半数致死量为5.0×107 CFU/mL）。攻毒保护试验结果表明典型融合菌株疫苗对YL1的攻毒保护率首免和二免后7d分别为40%、60%,对ZYD2的攻毒保护率首免和二免后7d分别为50%、70%。最后采用微量凝集实验对免疫鸭外周血抗体水平进行检测,结果表明典型融合菌株疫苗注入机体后,可刺激机体产生YL1抗体和ZYD2抗体,免疫后27 d左右抗体水平达最高峰,48 d后抗体水平开始下降,一次免疫ZYD2最高抗体效价（log2n）为4.8,二次免疫ZYD2最高抗体效价（log2n）为5.2；一次免疫YL1最高抗体效价（log2n）为4.6,二次免疫YL1最高抗体效价（Iog2n）为4.9。本研究成功融合鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌的原生质体,同时证明融合菌株具有两亲本菌株的抗原特性,对亲本菌株具有一定的免疫保护力,可刺激机体产生相应的抗体,为鸭源大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌融合菌株二联苗的研制打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 禽大肠杆菌研究概况
• 2 鸭疫里默氏杆菌研究概况
• 3 微生物原生质体融合
• 3.1 影响微生物原生质体融合的因素
• 3.2 微生物原生质体融合的方法
• 3.3 原生质体融合所得融合子的筛选方法
• 3.4 大肠杆菌原生质体融合及鸭疫里默氏杆菌原生质体融合的研究概况
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 亲本菌株的筛选
• 1 试验材料
• 1.1 试验菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要培养基及溶液
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 鸭疫里默氏杆菌亲本菌株筛选
• 2.2 鸭源大肠杆菌亲本菌株筛选
• 3 结果
• 3.1 RA的筛选结果
• 3.2 E.coli的筛选结果
• 4 讨论
• 第三章 鸭源大肠杆菌与鸭疫里默氏杆菌的原生质体融合
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 溶液配制
• 1.5 主要仪器
• 2 试验方法
• 1原生质体的制备与再生'>2.1 YL₁原生质体的制备与再生
• 2原生质体的制备与再生'>2.2 ZYD₂原生质体的制备与再生
• 2.3 原生质体形成率和再生率的测定和计算
• 2.4 原生质体融合及再生
• 2.5 融合菌株的检出及稳定性试验
• 2.6 血清学鉴定
• 2.7 生化鉴定
• 3 结果
• 3.1 原生质体制备条件的选择
• 3.2 融合子的再生与检出
• 3.3 血清学鉴定
• 3.4 融合菌株培养特性、菌落形态,形态染色及生化鉴定
• 4 讨论
• 第四章 典型融合菌株研究
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要器材
• 2 实验方法
• 2.1 典型融合菌株冷冻保存后稳定性测定
• 2.2 生长曲线测定
• 2.3 药敏试验
• 2.4 融合菌株毒力测定
• 2.5 疫苗研制
• 2.6 微量凝集试验检测免疫鸭外周血抗体水平
• 3 结果
• 3.1 典型融合菌株冷冻保存后稳定性测定
• 3.2 典型融合菌株及亲本菌株生长曲线
• 3.3 融合菌株药敏试验结果
• 3.4 典型融合菌株及亲本菌株毒力测定结果
• 3.5 融合菌株疫苗保护力测定结果
• 3.6 微量凝集实验结果
• 4 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士学位期间发表的学术论文