论文摘要
富含脯氨酸的核受体辅活化因子（proline-rich nuclear receptor coactivator, PNRC）是最近克隆和鉴定的一种新的核受体辅活化因子,是以类固醇源性生长因子（steridogentic factor 1, SF1）作诱饵,利用酵母双杂交系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的。PNRC通过其位于C端的SH3（src homology 3）结合模体发挥核受体辅活化因子作用,能以配体依赖的方式与多种核受体相互作用,还能与孤儿受体SF1和ERRα1以配体非依赖的方式相互作用。PNRC除了作为核受体的辅活化因子外,还通过SH3结合模体调节生长因子/Ras信号通路,竞争性抑制Ras蛋白的激活。PNRC在多种肿瘤组织及细胞中的表达明显低于正常组织和细胞,这提示PNRC的转录抑制与多种肿瘤的发生、发展相关。目前关于PNRC的转录调控机制尚不十分清楚,为了研究PNRC基因的转录调控机制及其转录抑制与多种肿瘤的发生、发展的相关性,我们进行了如下的研究:1.人PNRC基因转录起始位点的确定及启动子的活性分析采用5′端cDNA末端快速扩增法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）确定了PNRC转录起始位点的碱基为G,该转录起始位点较报道的PNRC mRNA （NM 006813） 5′端第一个碱基提前了27 bp。通过生物信息学预测软件（http://www.fruitfly.org/ cgi-bin/seqtools/promoter.pl.）对人PNRC基因的5′侧翼区约2100bp的序列进行分析,预测5′侧翼区内具有启动子功能的区域。应用TransFac professional 8.1（http://jupiter.coh.org/ cgi-bin/transfac/bin/start.cgi）软件对该区域进行分析,获得可能的转录因子结合位点。通过构建包含PNRC基因5′上游序列的荧光素酶报告质粒,利用脂质体瞬时转染,检测荧光素酶活性,对PNRC启动子区进行分析,结果显示,启动子活性最小区域位于-123 +27,预测结果表明,在这一区域可能存在着NFY和RFX1转录因子结合位点。2.细胞内、细胞外鉴定NFY和RFX1与PNRC基因启动子活性区域的结合染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）及电泳迁移率变动实验（electrophoresis mobility shift and supershift assay, EMSA）证明:NFY和RFX1可在细胞内、细胞外与PNRC启动子区域相结合。3.NFY和RFX1对PNRC基因启动子活性的调控NFY和RFX1真核表达质粒与PNRC启动子重组报告基因质粒或与突变报告基因质粒（含转录因子结合位点突变）的共转染实验表明:NFY和RFX1通过与PNRC启动子-123 +27区域结合,抑制PNRC启动子的活性,RT-PCR和Western blot证明:过表达NFY和RFX1可下调HepG2细胞中PNRC的表达。4.乳腺癌细胞中人PNRC基因启动子CpG岛甲基化状态的研究运用“MethPrimer”软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过硫化测序PCR （Bisulfite sequencing PCR, BSP）,检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况,结果显示:乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区存在CpG岛的甲基化。5.PNRC基因启动子CpG岛去甲基化对PNRC转录的调节将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,细胞再经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-CdR）处理后,检测PNRC基因启动子的活性;RT-PCR、Northern杂交、Western Blot检测乳腺癌细胞经5-Aza-CdR处理后PNRC的表达情况。结果证明:PNRC基因启动子CpG岛去甲基化可增强PNRC启动子活性并上调PNRC的表达。本研究对人PNRC基因5′侧翼区序列进行了一系列缺失分析,确定了启动子的最小活性区域-123 +27,并鉴定了与之相结合的转录因子NFY和RFX1对PNRC启动子的调节作用。此外,我们还从表观遗传学调控方面研究了PNRC基因启动子CpG岛的甲基化状态,发现乳腺癌细胞MCF-7中PNRC基因启动子区存在CpG岛的甲基化,对PNRC基因启动子CpG岛的去甲基化可增强PNRC启动子活性并上调PNRC的表达,进一步证明了PNRC在乳腺癌细胞中的转录抑制与PNRC启动子CpG岛的甲基化相关。本研究结果为阐明PNRC基因自身转录调控机制以及PNRC的转录抑制与肿瘤的相关性奠定了基础。