论文摘要
创伤、骨肿瘤手术切除造成的骨缺损,使得现有的骨替代材料已经无法满足临床需求。骨组织工程当今研究的重点,是一种开发能够修复、维持和改善损伤骨组织功能可被机体吸收的生物替代物来解决大段骨缺损的方法。人们逐步认识到构建以支架材料为骨架,复合干细胞,辅以生长因子的细胞繁殖三角模式是组织工程较理想的选择。本课题根据骨组织工程的基本原理,设计将富血小板血浆与强化磷酸三钙复合后加入凝血酶形成复合材料,构建新型强化磷酸三钙-胶原-多种生长因子（PRP）复合支架,随后选择和培养犬骨髓间充质干细胞并将种子细胞与支架相复合,植入比格犬体内观察其成骨情况,为构建理想的初步组织工程骨工程化产品,为建立骨组织工程的大型动物模型及进一步满足治疗骨缺损的临床需要提供理论基础。第一章犬骨髓间充质干细胞的提取、分离、纯化与增殖目的研究探讨犬骨髓间充质干细胞的分离、培养方法,以及生长增殖特性,并将其作为骨组织工程种子细胞的实验基础。方法无菌技术抽取比格犬骨髓,密度梯度离心法获取细胞。加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中进行原代培养;待细胞生长至80～90%融合时,1∶3传代培养。倒置显微镜观察细胞形态。MTT法测定3、5、10代细胞生长曲线。流式细胞仪检测第5代细胞的表面抗原分子。结果原代培养后24小时看见微少贴壁细胞,初起为小圆形,48小时后可见短梭形、梭形和多角形贴壁细胞,有初起克隆集落形成,并可见细胞分裂相;3天后可见梭形类成纤维细胞明显增多,5天左右进入对数生长期,8～10天单层细胞融合接近90%,呈漩涡样生长。1∶3传代的细胞2小时左右即可见细胞贴壁,一般10小时左右完成贴壁,生长增快,多数为类成纤维细胞,圆形细胞逐渐减少,6～7天细胞即可单层融合,传3代以后细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈漩涡样生长。10代以后细胞则逐渐有宽大梭形样变,增殖逐渐减缓,偶有细胞飘零。流式细胞仪检测传5代细胞有96%表达CD44,95%表达CD29,而只有5%表达CD34。生长曲线显示传3、5代骨髓间充质干细胞均有较强的增殖能力,其中传3代细胞更为明显,而传10代细胞的增殖能力较前有所减弱。结论犬骨髓间充质干分离提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,能够长期培养,符合组织工程种子细胞的基本条件。第二章富血小板血浆凝胶对犬骨髓间充质干细胞增殖及体外诱导分化的影响目的探讨比格犬骨髓间充质干细胞在特定培养基条件下的定向成骨分化能力。观察并分析富血小板血浆凝胶对比格犬骨髓间充质干细胞的增殖效应,分析最佳的浓度配比,以及富血小板血浆凝胶在比格犬骨髓间充质干细胞定向成骨分化中的作用。方法（1）如前述方法,分离培养比格犬骨髓间充质干细胞。（2）抽取27只比格犬后肢静脉血,两步离心法制备富血小板血浆,人工计数血小板后将富血小板血浆按1∶1的比例与含100u/ml牛凝血酶的10%氯化钙溶液激活剂混合反应形成凝胶。（3）MTT法测定不同浓度的富血小板血浆凝胶对传3代的比格犬骨髓间充质干细胞的增殖效应并选出最佳效应组。（4）将第3代比格犬骨髓间充质干细胞分为四组,分别加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM为Ⅰ组;含胎牛血清体积分数为0.1、地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L的高糖DMEM为Ⅱ组;含富血小板血浆凝胶最佳体积分数的低糖DMEM为Ⅲ组;含富血小板血浆凝胶最佳体积分数、地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L的高糖DMEM为Ⅳ组。倒置显微镜、HE染色观察各组细胞形态变化。碱性磷酸酶检测试剂盒检测各组细胞内碱性磷酸酶含量。茜素红S标记钙结节形成情况。免疫细胞化学染色检测各组骨钙素的表达。RT-PCR检测各组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果（1）人工血小板计数结果为静脉血中血小板为143.5士33.1×109/L,富血小板血浆为1239±174.07×109/L,为全血的8.6倍。（2）MTT法显示加入各种浓度富血小板血浆凝胶均可在早期促进比格犬骨髓间充质干细胞的增值。随着时间延长,各组表现不一。高浓度组增殖效果逐渐降低,而低浓度组表现优秀,而以6.25%组表现最佳。（3）倒置显微镜及HE染色观察Ⅱ、Ⅳ组细胞由梭型渐变为三角形、多角形、圆形,有自发聚集倾向,与Ⅰ、Ⅲ组有明显区别。Ⅲ组细胞增殖较Ⅰ组更快。各组碱性磷酸酶含量均随时间的延长而逐渐增高,各组比较而言,Ⅳ组活性最高,而Ⅰ、Ⅱ之间无显著性差异,成骨诱导14天,Ⅱ、Ⅳ组可见钙结节产生,茜素红S染色呈红色。成骨诱导14天后,骨钙素蛋白免疫细胞化学染色显示Ⅱ、Ⅳ组呈阳性。诱导后7,14天后RT-PCR鉴定各组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达,各组均分别在185bp、292bp及145bp有单一的目的条带,诱导后7,14天时间点Ⅱ、Ⅳ组组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平均强于Ⅰ、Ⅲ组;Ⅰ与Ⅲ组之间无显著性差异,而Ⅳ组各表达水平均强于Ⅱ组。结论富血小板血浆可显著促进骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆浓度相关,过高浓度可抑制骨髓间充质干细胞增殖。犬骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导培养下可定向成骨分化,并能够稳定表达成骨细胞特异性表型,具有成骨能力。富血小板血浆能显著增强诱导剂诱导成骨效果,但单独使用不能使骨髓间充质干细胞定向成骨分化。第三章强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料的制备及组织相容性研究并构建体外组织工程骨目的研究强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架的制备方法,分析该支架的生物相容性及生物力学性能。探讨强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架作为骨髓间充质干细胞载体的可能性。方法（1）如前述方法制备富血小板血浆备用。（2）将强化磷酸三钙柱状支架用毛笔刷掉表面粉末,生理盐水反复冲洗,烘干后高温消毒备用。（3）万用材料测试机测定其力学性能。（4）将准备好的强化磷酸三钙材料浸泡于富血小板血浆中,然后按1∶1的比例与含100u/ml牛凝血酶的10%氯化钙溶液激活剂混合反应形成强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架。将材料取出,去除表面多余的凝胶后备用。（5）如前述方法分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,取传3代细胞接种于备好的单纯强化磷酸三钙和强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架上。（6）于接种后4、8、12、24h取样测定第三代骨髓间充质干细胞在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架上黏附率。（7）分别于2、4、8天取样采用MTT法测细胞增殖率,并计算材料细胞毒性（8）2周后取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖以及基质分泌情况。结果（1）强化磷酸三钙为多孔结构,表面粗糙,呈白色,无异味,质地较韧。复合富血小板血浆凝胶后,可见空隙内充满凝胶。（2）垂直压缩力学实验显示强化磷酸三钙的平均最大载荷为942.49N,平均极限强度为13.634MPa。（3）细胞4、8、12、24h黏附率分别为52±2%、81±1%、92±2%及98±1%。（4）2、4、8天测定细胞相对增殖率RGR均大于1.0,评级为0级。（5）诱导组2周后扫描电镜观察,见细胞在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架表面分布较单纯强化磷酸三钙支架密集,并可见在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架空隙细胞延伸,基质分泌旺盛,甚至连接成片;未诱导组基质分泌较少。结论强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料可作为骨组织工程中骨髓间充质干细胞的细胞载体,无毒,生物相容性良好,兼具骨传导性和骨诱导性,基本满足骨组织工程的需要。第四章犬骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料体内构建组织工程骨的实验研究目的探讨了骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料体外定向成骨诱导后植入比格犬胫骨上段骨缺损中构建组织工程骨并修复体内骨缺损能力。方法（1）如第三章所述方法,比格犬骨髓间充质干细胞复合单纯强化磷酸三钙支架材料及强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架体外培养或诱导3周。（2）分别将细胞复合单纯强化磷酸三钙支架材料复合物、髂骨组及细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料复合物随机植入左、右胫骨平台下方圆洞形缺损处。观察植入物的表面变化、骨痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。（3）术后4、8、12周行X线片检查,观察X线片变化情况。（4）术后4、8、12周取材行HE染色及骨钙素蛋白免疫组织化学染色观察表达情况。（5）RT-PCR检测体内各组在4、8、12周时OCN、ALP、CollA1的mRNA的表达情况。（6）术后12周取各组胫骨上段,去除附属组织,于INSTRON8032万用测试仪上做垂直压缩实验比较各组力学性能。结果（1）各组材料复合体植入比格犬胫骨骨缺损后,伤口生长良好,没有全身和局部的炎症和毒性反应,伤口一期愈合。植入材料均未见明显炎症及排斥反应。（2）术后4、8、12周摄X线片结果显示髂骨组及强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组12周时基本达到骨质愈合,而单纯强化磷酸三钙材料组仍未见材料吸收、骨性愈合情况,材料-骨质界面清晰,材料周缘出现负影。（3）术后4、8、12周取材行HE染色及骨钙素蛋白免疫组织化学染色可见各组均可观察到新生软骨成骨情况,强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组表达较强化磷酸三钙材料组更强（4）各组在4、8、12周各组均可见OCN、ALP和CollA1的mRNA表达条带出现。比较4、8、12周各组目的条带和内参灰度值,8、12周时Ⅱ组和Ⅲ组各项表达强于Ⅰ组,Ⅱ组和Ⅲ组之间无明显区别。（5）比较各组力学性能显示强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组与髂骨组相比无明显区别,但较单纯强化磷酸三钙强度更好。结论强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合支架材料是一种理想的骨组织工程支架材料,在组织相容性、降解速度、力学性能及成骨效果等方面均令人满意。犬骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合支架材料经体外诱导后具有在比格犬体内构建组织工程骨的能力。
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