镉和壬基酚对鲫鱼肝细胞的毒理作用及联合作用的评价

论文摘要

镉和壬基酚是常见的两种环境污染物,近年来,随着工业生产中镉的使用量增加,及化学添加剂壬基酚聚氧乙烯醚（壬基酚前体物质）的广泛使用,环境中镉、壬基酚含量呈上升趋势。由于镉、壬基酚常与许多天然和人工污染同时进入环境,而引起复合污染,镉、壬基酚联合暴露给生物健康带来的一系列危害引起了广泛关注。肝脏是急性镉中毒的靶器官和蓄积部位,壬基酚可诱导鱼类肝脏卵黄蛋白原的合成,参与雌性性成熟过程,国内外研究者从环境污染、职业性暴露及动物实验多方面对镉、壬基酚所致肝毒性机理进行了研究,但两者联合毒性的研究则相对较少,本研究以鲫鱼原代培养肝细胞为模型,较系统的探讨了镉、壬基酚及其联合对鲫鱼肝脏的毒性损伤效应及作用机理,为进一步认识镉和壬基酚及其联合毒性作用提供理论依据。第一部分:无菌分离鲫鱼肝脏组织采用酶消化法分离肝细胞,并使用含有新生牛血清的M199培养基对其进行体外培养,通过形态学及台盼蓝染色法的鉴定,分离的肝细胞完整,呈圆形,存活率90%以上,说明该方法是较为理想的肝细胞培养法。在此基础上增加了:葡萄糖洗必泰对组织块的消毒,Percoll分离液对细胞的纯化,胎牛、新生牛血清对细胞培养的影响等3个部分的内容,发现使用葡萄糖洗必泰和新生牛血清对原代肝细胞培养有利。第二部分:镉的肝细胞毒性研究了镉诱发鲫鱼肝细胞相关的胞内游离钙离子变化,以及Ca2+-ATP酶及金属硫蛋白表达量的变化。试验分为对照组、5、10、15、20μmol/LCdCl25个组。Ca2+用Fura-2/AM方法检测,试验后24h用荧光倒置显微镜观察细胞内游离钙离子变化;分光光度法检测Ca2+-ATP酶;石墨炉—原子分光光度法检测了细胞内镉离子浓度;免疫酶联法（ELISA）检测了金属硫蛋白（MT）含量。结果显示,镉可导致细胞存活率下降,具有一定的毒性。镉离子引起胞内Ca2+荧光强度和Ca2+-ATP酶活性增加（P<0.01）。随镉浓度升高,处理组Ca2+-ATP酶浓度活性分别是对照组的6.73、6.68、7.19、6.18倍;暴露24h后各组细胞内镉离子均有上升,其中5μmol/L组最高,达2.045±0.322μmol/L;各处理组金属硫蛋白（MT）含量增高（P<0.01）,且5μmol/L低浓度组MT增幅最大,达17.15%。结果提示,镉诱导下细胞内Ca2+升高,MT表达量上升,且MT可螯合进入细胞内的镉离子,这种螯合可能是降低镉毒理作用的机制之一。第三部分:壬基酚的肝细胞毒性研究了壬基酚诱发鲫鱼肝细胞相关的胞内游离钙离子变化,以及Ca2+-ATP酶及金属硫蛋白表达量的变化。试验分为对照组、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/LNP 6个组。Ca2+、Ca2+-ATP酶、MT的检测方法同镉。结果显示,壬基酚可抑制肝细胞增殖,并且高浓度组的细胞与对照组相比增殖能力显著下降,倒置显微镜的细胞形态观察显示,10-3mol/LNP对细胞产生了明显的细胞毒性,细胞形态发生明显改变。随着壬基酚浓度的升高,MT表达量呈现U型变化趋势,10-7、10-5μmol/L引起MT表达量的升高（P<0.05,P<0.01）,10-6mol/L组MT表达量显著下降（P<0.01）,高浓度组组同对照组无显著性差异。根据细胞存活率及MT表达量差异选择10-6、10-4μmol/L作为受试浓度,进一步检测发现壬基酚离子引起胞内Ca2+荧光强度和Ca2+-ATP酶活性增加（P<0.01）。随壬基酚浓度升高,处理组Ca2+-ATP酶活性分别是对照组的分别增加了6.2、4.6倍。结果提示,壬基酚引发细胞内Ca2+升高,是细胞损伤的机制之一。第四部分:镉和壬基酚的联合作用采用3种联合作用评价方法毒性单位法、相加指数法、混合毒性指数法对结果进行分析,得到的结论一致,镉和壬基酚在受试范围内均呈协同作用,毒性从强至弱分别为20μmol/L Cd+10-4 mol/L NP组、15μmol/L Cd +10-4mol/L NP组、20μmol/L Cd +10-6mol/L NP组、10μmol/LCd +10-4mol/L NP组、15μmol/L Cd +10-6mol/L NP组、5μmol/L Cd +10-4mol/L NP组、10μmol/L Cd +10-6mol/L NP组、5μmol/L Cd +10-6mol/L NP组,、5μmol/L Cd +10-6mol/L NP组的协同作用最强,20μmol/L Cd+10-4 mol/L NP组最弱。单独作用的Cd和10-4mol/LNP没有抑制MT的表达,而联合作用下出现抑制;联合作用时Ca2+-ATP酶活性与镉单独作用时相比出现下降。结论:镉和壬基酚有协同作用,MT和Ca2+-ATP酶可作为协同作用的评价的参考指标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 水环境污染现状
• 2 污染物的主要类型
• 2.1 重金属毒性物质——镉
• 2.2 有机有毒物——壬基酚
• 3 镉、壬基酚的作用机制
• 3.1 镉毒性作用机制
• 3.2 壬基酚的内分泌干扰机制
• 4 镉、壬基酚作用的经典指示物
• 4.1 金属硫蛋白
• 4.2 卵黄蛋白原
• 5 本实验研究意义
• 第一章 肝细胞原代培养模型的建立
• 1 材料
• 1.1 实验用鱼
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 实验使用溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 鲫鱼肝细胞的分离
• 2.2 细胞的显微形态观察
• 3 结果
• 3.1 葡萄糖洗必泰的消毒作用
• 3.2 细胞分离液的纯化效果
• 3.3 两种血清对血细胞凝集及细胞贴壁的影响
• 2+-ATP 酶和金属硫蛋白的作用'>第二章 镉离子对鲫鱼肝细胞的钙、Ca²⁺-ATP 酶和金属硫蛋白的作用
• 1 材料
• 1.1 实验用鱼
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 实验使用溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 鲫鱼肝细胞的分离
• 2.2 细胞的显微形态观察
• 2.3 细胞增殖活性检测
• 2.4 氯化镉暴露及检测样品的处理
• 2.5 钙离子荧光染色
• 2+-ATP 酶的测定'>2.6 Ca²⁺-ATP 酶的测定
• 2.7 金属硫蛋白的ELISA 检测
• 2.8 镉离子浓度测定
• 2.9 数据处理
• 3 结果
• 3.1 原代培养细胞形态观察
• 3.2 细胞增殖活性检测
• 3.3 肝细胞内游离钙离子荧光染色
• 2+-ATP 酶活力增加'>3.4 氯化镉诱发Ca²⁺-ATP 酶活力增加
• 3.5 氯化镉诱发金属硫蛋白表达量的升高
• 3.6 细胞内镉离子浓度
• 4 讨论
• 4.1 氯化镉对鲫鱼细胞增殖的影响
• 4.2 氯化镉对鲫鱼原代培养肝细胞内钙离子的影响
• 4.3 氯化镉对肝细胞金属硫蛋白的影响
• 2+-ATP 酶和金属硫蛋白的作用'>第三章 壬基酚对鲫鱼肝细胞的钙、Ca²⁺-ATP 酶和金属硫蛋白的作用
• 1 材料
• 1.1 实验用鱼
• 1.2 试剂和仪器
• 1.3 实验使用溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 鲫鱼肝细胞的分离
• 2.2 细胞的显微形态观察
• 2.3 细胞增殖活性检测
• 2.4 壬基酚暴露及检测样品的处理
• 3 结果
• 3.1 鲫鱼肝细胞形态观察
• 3.2 细胞增殖活性检测
• 3.3 NP 对MT 表达量的影响
• 2+-ATP 酶活力增加'>3.4 NP 诱导Ca²⁺-ATP 酶活力增加
• 2+的影响'>3.5 NP 对细胞内Ca²⁺的影响
• 4 讨论
• 4.1 NP 对细胞活性的影响
• 4.2 NP 对MT 表达量的影响
• 2+的影响'>4.3 NP 对细胞内Ca²⁺的影响
• 2+-ATP 酶的影响'>4.4 NP 对Ca²⁺-ATP 酶的影响
• 第四章 镉和壬基酚联合作用的评价
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 联合毒性评价
• 2+-ATP 酶活力的影响'>2.2 镉和壬基酚联合作用对Ca²⁺-ATP 酶活力的影响
• 2.2 镉和壬基酚联合作用对MT 表达量的影响
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢