棉花增强子捕获系群体的创建与初步分析

论文摘要

棉花作为世界上重要的经济作物,在国民经济中具有重要的地位,但其功能基因组的研究却相对落后。为了配合植物功能基因组高通量研究的发展方向,构建棉花的突变体库已成为必然,借助于理论上可以获得基因组中任一基因的突变体,最终实现阐释基因功能的目的。目前,研究基因的功能主要是创造基因的突变体,寻找基因的突变表型来阐释基因的功能。Enhancer trap技术作为功能基因组研究的有力工具,它往往以T-DNA为载体将Enhancer trap元件随机插入到植物基因组中创建植物Enhancertrap系,通过检测不同Enhancer trap系中报告基因的表达模式来发掘新基因及其调节序列。本研究采用农杆菌介导的转基因方法,旨在构建棉花T-DNA插入的Enhancer trap突变体库。在这两年的研究中,取得了以下几个方面的进展:1.建立了农杆菌介导的棉花品种‘YZ1’高效遗传转化体系,抗性愈伤率为70%-80%,60%的抗性愈伤再生成植株。高效的遗传转化体系为大规模创造棉花T-DNA插入突变体库奠定了基础。2.总共获得了84个独立转化子,82%的转化植株PCR检测为阳性。3.本研究发现不同细胞系的再生植株的GUS报告基因的表达模式相差很大,这种现象支持T-DNA插入是随机事件的假说。GUS基因在PCR检测呈阳性的植株中,有很多是特异性表达的,其中在愈伤组织中的表达频率最高达到63.1%,在胚状体中的表达频率为47.6%,在花中的表达频率为28.6%,根部的表达频率为31%。4.采用TAIL-PCR、PCR-Walking的方法扩增棉花T-DNA侧翼序列,其结果如下:运用TAIL-PCR方法只是前两轮得到smear;运用PCR-Walking方法扩增得到600 bp和800 bp的片段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 棉花的概述
• 1.2 植物基因组研究的概述
• 1.2.1 棉花功能基因组研究概述
• 1.2.2 利用突变体开展正向和反向遗传学研究
• 1.2.3 代谢组学和蛋白质组学
• 1.2.4 生物信息学的发展
• 1.2.5 基因表达谱分析
• 1.3 T-DNA标签技术及其在植物功能基因组研究中的应用
• 1.3.1 T-DNA转移和整合的机理
• 1.3.2 T-DNA插入标签研究基因功能的策略
• 1.3.3 获得功能突变体
• 1.3.4 T-DNA插入突变在棉花基因功能研究中的应用现状
• 1.4 农杆菌介导的基因转化法
• 1.4.1 农杆菌转化的机理
• 1.4.2 影响农杆菌T-DNA转移的因素
• 1.5 增强子捕获元件插入片段侧翼序列的扩增及分析
• 1.5.1 质粒拯救（Plasmid rescue）
• 1.5.2 反向PCR（I-PCR）
• 1.5.3 热不对称交错PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR）
• 1.5.4 T-linker PCR（T-linker-specific ligation PCR）
• 1.5.5 PCR-Walking
• 1.6 本研究的意义及技术路线
• 1.6.1 本研究的意义
• 1.6.2 技术路线
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 品种
• 2.1.2 农杆菌菌株和转化载体
• 2.1.3 部分试剂来源
• 2.1.4 培养条件及其不同培养基配方
• 2.1.5 缓冲液和培养基配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 以棉花下胚轴为受体的遗传转化
• 2.2.2 转化愈伤及再生植株不同器官的GUS染色
• 2.2.3 转化材料的分子鉴定
• 2.2.4 转基因当代材料的农艺性状考察
• 2.2.5 采用TAIL-PCR、PCR-Walking方法扩增棉花T-DNA侧翼序列。
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花下胚轴转化及转基因株系的获得
• 3.2 Enhancer trap T0代群体GUS检测
• 3.2.1 GUS基因在突变群体的表达频率
• 3.2.2 GUS基因在不同体细胞胚胎发育阶段中的表达频率
• 3.2.3 GUS基因在根中的表达模式
• 3.2.4 GUS基因在花器官中的表达模式
• 3.3 转基因再生植株的PCR检测
• 3.4 转基因再生植株的农艺性状考察
• 3.5 采用TAIL-PCR、PCR-Walking的方法扩增棉花T-DNA侧翼序列
• 3.5.1 运用TAIL-PCR方法扩增T-DNA侧翼序列
• 3.5.2 运用PCR-Walking方法扩增T-DNA侧翼序列
• 4 讨论
• 4.1 Enhancer trap系统的有效性
• 4.2 关于T-DNA插入饱和突变体库的构建
• 4.3 GUS基因表达的时空特性
• 4.4 T-DNA侧翼序列的分离
• 参考文献
• 致谢