人细胞色素P450 1A2、2C9、2E1和3A4基因克隆及表达

论文摘要

本课题旨在通过基因克隆和异源表达的方法,获得由特定基因所表达的重组细胞色素P450药物代谢酶,为以后的酶活性鉴定和酶代谢功能研究奠定基础。1目的基因的克隆与重组病毒的构建分别以国外获赠的含有CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4基因的质粒为模板进行PCR扩增目的基因,同时以人肝细胞cDNA为模板PCR扩增CYP2C9基因。对于CYP1A2和CYP2E1,分别在5’端添加EcoRⅠ酶切位点,3’端添加KpnⅠ酶切位点,对于CYP2C9和CYP3A4,分别在5’端添加SalⅠ酶切位点,3’端添加KpnⅠ酶切位点。将目的基因克隆至pCMV-Myc载体上并进行DNA测序,结果证实已获得完整正确的目的基因。将经过双酶切的目的基因片段插入经同样双酶切后的pFastBacl转座载体中,重组质粒转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,转座后产生重组粘粒DNA（Bacmid）。将该重组粘粒转染Sf9细胞后,即产生重组杆状病毒。2重组蛋白表达将重组杆状病毒以0.01-0.1的MOI值感染生长良好的Sf9细胞来扩增重组病毒,使病毒滴度达到108pfu/mL或更高,然后将重组病毒以MOI值5感染Sf9细胞,表达目的蛋白。收集表达72h后的Sf9细胞,经超声破碎及离心后得到含重蛋白的溶解液。测定蛋白浓度。3重组蛋白表达分析Western Blot结果显示CYP1A2、CYP2C9重组蛋白分别能与羊抗人CYP1A2、CYP2C9多克隆抗体特异性结合,这表明CYP1A2、CYP2C9基因正确插入表达载体中得到正确表达。SDS-PAGE电泳结果可见CYP1A2、CYP2C9蛋白重组CYP2E1蛋白和重组CYP3A4蛋白表达条带,表明CYP2E1、CYP3A4基因得到正确表达。综上所述,本实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）分别表达了人CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4重组酶,其中CYP1A2和CYP2C9经过Western Blot鉴定,结果正确。CYP2E1和CYP3A4经过蛋白电泳检测结果正确。本实验为以后的酶活性鉴定和酶代谢功能研究奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 1. 基本实验操作
• 2. CYP1A2基因克隆及表达实验方法
• 3. CYP2C9基因克隆及表达实验方法
• 4. CYP2E1基因克隆及表达实验方法
• 5. CYP3A4基因克隆及表达实验方法
• 实验结果
• 1. CYP1A2基因的克隆和表达
• 2. CYP2C8基因的克隆和表达
• 3. CYP2E1基因的克隆和表达
• 4. CYP3A4基因的克隆和表达
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 发表文章情况
• 附录
• 致谢