论文摘要
[研究背景]肺癌是一种常见的恶性肿瘤,在美国,肺癌是导致癌症患者死亡的头号杀手[1]。近二十年来,随着人口老龄化和人类生活环境的污染与破坏,肺癌在我国癌症的总体发病率和死亡率中也呈上升趋势。目前研究发现,肺癌患者中,一些原癌基因如MYC、KRAS、EGFR等都与肺癌的发展及预后息息相关,由此也衍生出针对该些基因异常改变的分子靶向治疗【2】。近年来,肺癌的治疗手段不断发展,但5年的生存率仍然仅有15%【3】。肺癌的远处转移,是导致肺癌低生存率的主要原因【4】。如何早期准确发现肺癌尤其是隐匿性肺癌,并给予合适的治疗,是改善肺癌生存率的关键点,这就需要一个更为敏感和特异性的指标,为我们在临床的诊断和有效治疗的指导方面提供可靠的依据。肺癌的早期发现及有效治疗,目前已成为人类针对肺癌研究的重点方向之一NKX2-1（NKX homeobox-1 gene, NKX同源框一1基因）,又称甲状腺转录因子-1（TTF-1）, T/EBP（甲状腺特异性增强结合蛋白）,是NKX2基因家族中的一个包含同源结构域的转录因子。1989年,Civitareale等人【5】在甲状腺细胞FRTL-5中研究甲状腺球蛋白启动子时发现了NKX2-1. NKX2-1选择性的表达于胚胎和成熟的肺组织、甲状腺上皮细胞及广泛分布于前脑腹侧[6]。NKX2-1持续地表达于人类胚肺和成年肺中,以维持肺的正常发育及功能,而它的异常表达则与肺部的一些疾病密切相关,尤其与肺癌的关系。目前,临床上越来越多的研究发现可将其作为判断肿瘤组织来源是否为肺腺癌原发【7-12】以及判断是否肺源性恶性间皮瘤的一个关键指标【13-16】。NKX2-1特异性表达于肺部并高表达于肺腺癌患者【17,18】,Kwei等人【18】的临床研究中还提出NKX2.1可能是肺癌的一个驱动核心,是肺腺癌生长并存活的必要因素,同时还可能是癌症复发的危险因子。影响肺癌预后的因素很多：如肺癌的病理组织类型、肺癌的分期、治疗方案的敏感及耐受性等,但综合分析,可能都与个体间一些关键性的基因不同有关【2】。NKX2-1与肺腺癌特异的关系,可以帮助判断肺源性腺癌,那么对于肺癌的预后判断是否也有帮助?尽管有部分研究报道了NKX2-1与肺癌预后的关系,但针对两者相关性的研究仍无明确定论。NKX2-1与非小细胞肺癌预后研究结果不一致的原因,与抗癌药物的敏感性是否相关?与肺癌细胞的增殖、坏死及转移能力是否有关?那么,明确NKX2-1在肺癌中的表达及与肺癌生长增殖的关系,发现NKX2-1与抗肿瘤药物之间的关联,是否可能为肺癌的发现及指导化学药物有效治疗开辟新的应用前景?[目的]1.明确NKX2-1在不同肺癌细胞株以及在肺癌患者血清中的蛋白表达；2.明确NKX2-1与肺癌细胞生长、坏死和迁移的关系；3.明确NKX2-1与不同抗癌药物疗效之间的关系。4.初步研究NKX2-1与EGFR的相关性。重点研究NKX2-1在不同肺癌细胞株中的表达以及它与不同抗癌药物疗效之间的关系,并以此为细胞学的研究依据,为后期临床药物疗效和NKX2-1与肺癌临床预后关系的进一步验证打好理论基础。[方法及思路]第一部分：培养9株肺癌细胞,提取蛋白质,Western-blot法检测NKX2-1蛋白质在各个肺癌细胞株中的表达水平；选出NKX2-1高表达和低表达的细胞,初步观察两株细胞不同的生长、迁移能力,坏死状态以及对顺铂药物的敏感性。细胞坏死用PI单染方法观测细胞坏死指数；细胞生长、细胞迁移以及药物作用后细胞状态的改变,均使用xCELLigence RTCA系统实时检测并分析。第二部分：使用GeneCopoeia公司构建的带有eGFP的NKX2-1质粒载体,瞬时转染到NCI-H1299细胞中,BD FACSAria流式细胞仪分选细胞并用G418筛选出稳定高表达NKX2-1的NCI-H1299细胞；观察NKX2-1低表达和高表达后,NCI-H1299细胞生长坏死及迁移的改变,并用4种不同化疗药物（顺铂、多西他赛、吉非替尼和吉西他滨）的不同浓度进行干预,观察并分析细胞增殖能力的改变。最后用Western-blot的方法,检测NKX2-1的表达与EGFR的关系。第三部分：检测肺癌患者和正常人血清中NKX2-1蛋白的表达量,不同病理类型和不同分期肺癌患者的NKX2-1蛋白的表达含量。[结果]一、NKX2-1在肺癌细胞株的表达：以GADPH为对照,低／不表达细胞NCI-H1650, NCI-H1299, NCI-H1993和SKMES-1;高表达的细胞Bease-2B, NCI-H358, HCC827, A549和NCI-H446.其中,肺腺癌细胞株中,NCI-H358 NKX2-1蛋白表达最高,NCI-H1650和NCI-H1299表达低。二、细胞迁移能力：1.高表达NKX2-1蛋白的NCI-H358细胞迁移能力明显低于NKX2-1蛋白低表达的NCI-H1299和NCI-H1650;2.经转染前后验证,高表达NKX2-1蛋白细胞迁移能力明显下降。三、细胞增殖：1.不同NKX2-1表达量的NCI-H358和NCI-H1299生长状态存有差异。2.经转染NKX2-1验证,NKX2-1高表达后的NCI-H1299细胞,生长增殖能力在24-48小时与未转染细胞增殖能力相似,72小时以后,前者生长能力明显减弱。NKX2-1高表达的细胞,其增殖能力的时间较NKX2-1低表达的细胞短,且可能更早时间的出现明显的坏死。四、细胞坏死：1.高表达NKX2-1蛋白的NCI-H358细胞在顺铂作用下,坏死明显多于NKX2-1低表达的NCI-H1650和NCI-H1299,但后两者之间坏死亦存在有差异。2.经稳定转染NKX2-1在NCI-H1299细胞中,发现12-48小时,两者细胞坏死无明显差异；48-72小时,高表达NKX2-1的细胞坏死指数明显高于低表达的细胞。五、镜下细胞生长：高表达NKX2-1蛋白的NCI-H358细胞生长状态差；低表达NKX2-1蛋白的NCI-H1299在顺铂作用后的24-48小时生长状态较好,72小时细胞死亡明显增多；该结果与NKX2-1的表达不成明显相关性,可能与细胞本身生长的方式及状态相关。六、抗癌药物的有效性：经NKX2-1转染高表达后验证：1.顺铂：NKX2-1高表达后的NCI-H1299细胞对顺铂的反应性明显低于该基因低表达的细胞,且随着药物作用时间的增加而呈现明显耐药。2.吉非替尼：该药对细胞生长增殖能力与NKX2-1的表达高低无相关性。3.多西他赛：该药对NKX2-1高表达的NCI-H1299细胞的抑制作用能力明显低于NKX2-1低表达的NCI-H1299细胞,且与作用时间呈正相关。4.吉西他滨：对NKX2-1高表达的NCI-H1299细胞的抑制作用能力明显高于NKX2-1低表达的NCI-H1299细胞,且与作用时间呈正相关。七.NKX2-1与EGFR的关系：Western-blot方法检测,NCI-H1299.NCI-H1299NEG和NCI-H 1299Nkx2.1细胞的EGFR蛋白表达总量相同。提示,NKX2-1对肺癌细胞生物学功能的影响可能与EGFR总量的表达无明显相关性。八、肺癌血清中NKX2-1蛋白的表达：1.肺癌患者血清中NKX2-1的表达量明显高于正常人血清中NKX2-1的表达。2.NKX2-1在不同肺癌病理组织类型及分期中的表达,无明显差异。[结论]1.NKX2-1在不同肺癌细胞株的表达不同：主要高表达于腺癌和小细胞肺癌细胞株,鳞癌细胞株为低表达。2.NKX2-1高表达的肺癌细胞可能对吉西他滨的敏感性高于顺铂以及多西他赛。我们的这一发现可能为临床化疗药物选择上提供导向信息。3.NKX2-1高表达可促进肺癌细胞坏死并抑制肺癌细胞增殖；NKX2-1高表达可抑制肺癌细胞的迁移。4.血清NKX2-1蛋白的表达,可能是发现肺癌较为敏感和便捷的指标。5.NKX2-1发挥生物学功能的相关分子信号通路,可能与改变EGFR总量无直接相关性。