松花粉对衰老人胚肺成纤维细胞p16及p21基因表达的影响

论文摘要

研究背景:老龄化社会的到来使老年相关性疾病越来越受到关注。有观点认为预防老年相关性疾病的一个重要方法即延缓机体“衰老”的发生。因此,延缓机体衰老有利于改善老年人的健康素质,有利于降低老年性疾病的发病率和恶性程度,有利于减少社会老年性疾病的治疗成本。自Hayflick等提出了细胞复制性衰老的假说以来。大量的实验研究证实,衰老细胞的复制受限是一种受体内衰老相关的多组基因调控的内在机制,它们主要是一组与癌症相关的组抑癌基因,包括p53,pRB,p16INK4A和p21CIP-1等。早期的研究证明衰老的诱发因素可分为端粒与非端粒性诱发因素。目前观点认为端粒缩短诱发衰老与激活了衰老相关p53～p21通路有关,诱发衰老的非端粒性因素:包括自由基、线粒体DNA损伤、放射线损伤等均与细胞结构性损伤在胞内蓄积有关,其诱发衰老具有一条共同的下游通路,即p16-pRb通路。衰老理论的创新为抗衰老药物的筛选和药效研究提供了有力的依据。目前抗衰老药物的筛选研究也主要通过抑制细胞的衰老表观改变,改善衰老诱发因素的负效应和调控衰老相关基因的表达来验证其衰老效果。大批中药材在古代医典中记载着具有延年、益寿之效,如何将具有延缓衰老作用的传统中药材推向国际市场,成为了中药现代化开发的新课题。松花粉始载于东汉·《神农本草经》,为鲜黄色或淡黄色细粉,气味甘平无毒,久服轻身益气力,延年。国外有报道,从松树皮中提取出的“松树多酚”被认定为目前具抗衰老效果最强的生物活性物质。那么松花粉蕴含松树繁殖的全部营养,其抗衰老效果又如何呢?本课题已完成的实验,证实松花粉具有促进细胞增殖、抑制自由基表达、提高端粒酶活性和降低线粒体mtDNA4977突变率等作用。从抑制衰老诱发因素的负效应、促进细胞增殖等方面验证了松花粉的抗衰老效果。那么,松花粉对于衰老细胞复制受限性的内在基因调控机制又有何影响呢?衰老通路中的相关基因p16INK4A,p21CIP-1又会有怎样的变化呢?研究目的:分析松花粉对细胞复制性衰老中p16INK4A,p21CIP-1表达的影响。由于衰老细胞具有三项特征性的改变:细胞面积增大、β-半乳糖苷酶染色（SA-β-gal）呈蓝染、细胞G1期阻滞。取该三项指标来验证衰老细胞模型的质量,同时探讨松花粉对衰老细胞中该三项指标的影响。依据衰老发生的基因调控学说,选取癌基因p16INK4A和p21CIP-1作为衰老检测的分子指标,检测松花粉对其在衰老细胞中表达的影响。从衰老发生的基因调控层面,探讨松花粉的抗衰老效果并分析其分子机制。本课题主要有以下研究:①建立衰老细胞模型,检测松花粉干预对各组的单细胞面积、β-半乳糖苷酶染色（SA-β-gal）阳性率以及细胞周期的影响,从形态学、生化和DNA分布改变等外在表观方面来确定松花粉的抗细胞复制性衰老的作用。②由于p16(INK4A与p21CIP-1分别是p53-p21-pRb和p16-pRb两条细胞衰老信号途径中的核心成分,且表达量变幅大,易于测定。选取p16INK4A与p21CIP-1基因作为研究的靶目标,设定了两个松花粉血清液浓度点,来测定在衰老细胞中不同浓度松花粉血清液干预对其p16INK4A与p21CIP-1mRNA表达量的影响。材料与方法:①细胞处理:人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）从27代开始培养,随机取8瓶30代细胞为年轻对照组。培养至56代建立衰老细胞模型后,取24瓶细胞随机分成三组:衰老模型组、松花粉中剂量（120mg/dl）组、松花粉高剂量（240mg/dl）组。分别辅以普通MEM血清培养基、120mg/dl松花粉血清液、240mg/dl松花粉血清液进行培养。②松花粉血清液配制:本课题采用花粉营养液的浸提技术,提取出水溶性的花粉营养液作为细胞实验的干预材料,以水溶性复合体的形式研究松花粉水溶性成分的整体抗衰老药效学机制。③单细胞面积、SA-β-gal染色阳性率和细胞周期的测定:采用体视学方法测定各组的平均单细胞面积,并比较松花粉处理对各平均单细胞面积的影响;免疫组化法对各组细胞进行SA-β-gal染色,测定各组的平均蓝染细胞比率,即染色阳性率的变化,并比较松花粉处理对其的影响;流式细胞术分析各组的细胞G0/G1、S、G2/M期比例分布状况,计算各组的PI指数,并比较松花粉处理对细胞周期分布与PI指数的影响。④P16INK4A与p21CIP-1的测定:RT-PCR法测定各组细胞内P16INK4A、p21CIP-1mRNA的表达量,比较衰老细胞组与不同浓度松花粉血清液组间p16INK4A与p21CIP-1mRNA表达的差异。⑤统计分析:采用SPSS 13.0分析数据。方差齐性时,行单因素方差分析,LSD方法行组间两两比较:方差不齐时,行多个独立样本非参数检验,Dunnett’s T3法行组间两两比较,P≤0.05差异有统计学意义。结果:①衰老模型组细胞出现单细胞面积显著增大（P=0.023）,SA-β-gal阳性率与G1期比例显著增高（P=0.001）,PI指数显著下降（P＜0.001）。②松花粉血清液处理后,衰老细胞的单细胞面积显著减小（P＜0.02）、SA-β-gal染色阳性率与G1期比例均显著下降（P＜0.001）,PI指数显著升高（P＜0.05）;在松花粉高剂量与中剂量组之间,细胞周期差异有显著性（P=0.003）。③衰老模型组细胞中p16INK4A与p21CIP-1的mRNA表达量均显著上调（P＜0.001,P=0.044）,松花粉血清液处理后,p16INK4AmRNA表达量出现显著的下调（P＜0.001）,在高剂量（240mg/dl）组与中剂量（120mg/dl）组处理组之间,差异有显著性（P=0.006）。松花粉血清液处理后,p21CIP-1mRNA的表达量无明显改变（P=0.061）。结论:①自然衰老2BS细胞模型建立成功,出现典型的衰老形态特征,单细胞表面积、SA-β-gal染色阳性率、细胞周期等表观指标和p16INK4A、p21CIP-1mRNA表达量出现典型的衰老相关的改变。②明确了松花粉的抗衰老效果,表现为衰老细胞的形态改变和单细胞表面积、SA-β-gal染色阳性率、细胞周期等表观指标的改变均有显著改善。③设立了两个不同的松花粉血清液处理浓度,在高剂量（240mg/dl）和中剂量（120mg/dl）松花粉血清液浓度间,细胞G1期比例,PI指数,p16INK4AmRNA表达量的差异有显著性,提示松花粉抗衰老效果有剂量依赖性。④探讨松花粉抗衰老的分子机制,在衰老模型细胞中p16INK4A,p21CIP-1的表达量均出现显著上升,但是经松花粉处理后,p16INK4AmRNA表达量出现显著下调,p21CIP-1mRNA表达量的变化无统计学意义。提示在抗2BS细胞衰老过程中,p16-pRb信号途径可能为松花粉抗衰老的主要作用通路。⑤松花粉具有抗2BS细胞复制性衰老的作用,其机制可能与下调p16INK4AmRNA的表达,减弱p16INK4A从对G1/S调控点的抑制作用,改善细胞G1期阻滞状况,促进DNA合成和细胞增殖,而实现抗细胞复制性衰老的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 松花粉对衰老人胚肺细胞单细胞面积、β-半乳糖苷酶染色染色阳性率和细胞周期的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• INK4A，p21^CIP-1 mRNA表达的影响'>第二章 松花粉对衰老人胚肺细胞p16^INK4A，p21^CIP-1mRNA表达的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 攻读学位期间成果
• 附录
• 文献综述
• 中英文缩写词对照表
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明