论文摘要
目的:恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命,近半个世纪来,运用中草药治疗恶性肿瘤,越来越被广大学者和患者接受,并已成为常用的治疗方法,是恶性肿瘤综合治疗中的有效手段之一。临床实验证明,中草药有较好抗肿瘤作用,不仅对化、放疗起到减毒、增敏、增效的效应,而且能预防肿瘤的复发及转移。中草药以无明显毒副作用、药源广泛、价格低廉、宜长期应用等特点在恶性肿瘤治疗中显示其独特的优势。近些年来,关于中草药的有效成分及作用机理的研究也越来越受关注,如长春新碱（VCR）、紫杉醇（PTX）已经被广泛应用于临床,并取得了良好的临床效果。但是,目前应用于临床的中草药中有效成分药仍然较少,因此,从中草药中开发研制新的抗肿瘤药成为恶性肿瘤治疗的重要课题之一。FTY720是中国传统中药冬虫夏草有效成分ISP-1经改造而成,有良好的免疫抑制作用,可用于移植后排斥反应及自身免疫疾病的治疗。此外国外有关于FTY720可引起肿瘤细胞凋亡而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用的报道。目前国内很少有关于FTY720在肿瘤方面作用的报道。因此FTY720的抗肿瘤作用及其机制的研究具有广阔的前景。本实验通过研究新型免疫抑制剂FTY720体外抗肿瘤及诱导肿瘤细胞凋亡的作用,并进一步探讨其作用机制,为将来这种新型药物在抗肿瘤方面作用的开发提供理论基础。方法:1)利用MTT比色法测定不同剂量组的FTY720对Hep-2,Hela,A549,SMMC-7721细胞增殖的影响;2)倒置显微镜下观察不同剂量组FTY720作用于Hep-2细胞6小时后细胞形态学的变化;3)利用Hochest33342/PI染料,在荧光显微镜观察不同剂量组的FTY720对Hep-2细胞作用6小时后细胞形态学的变化;4)利用流式细胞仪Annexin V/PI双染技术,测定不同剂量组的FTY720作用于Hep-2细胞6小时后对细胞凋亡的影响;5)利用流式细胞仪PI单染技术,测不同剂量组的FTY720作用于Hep-2细胞6小时后对细胞凋亡率的影响;6)利用分光光度法测定不同剂量组的FTY720作用于Hep-2细胞6小时后,对细胞内凋亡相关蛋白caspase-9活性的影响。结果:1)FTY720对Hep-2,Hela,A549,SMMC-7721的增殖有明显的抑制作用。①与Hep-2细胞作用结果:除了40μg/ml组与20μg/ml组间差别无统计学意义外,不同剂量组间比较OD值的差别也有统计学意义（F=454.726,P＜0.01,）IC50值为4.05402μg/ml,②与Hela细胞作用结果:除了40μg/ml组与20μg/ml组间差别无统计学意义外,不同剂量组间比较OD值的差别也有统计学意义（F=2357.490,P＜0.01）其IC50值为3.35259μg/ml,③与A549细胞作用结果:除了40μg/ml组,20μg/ml组与10μg/ml组间差别无统计学意义外,不同剂量组间比较OD值的差别也有统计学意义（F=4941.806,P＜0.01）其IC50值为4.36825μg/ml,④与SMMC-7721细胞作用结果:不同剂量组间比较OD值的差别也有统计学意义（F=745.166,P＜0.01）。其IC50值为4.20633μg/ml。2)倒置显微镜下明显看到,给药6小时后Hep-2细胞呈现典型的细胞凋亡形态学特征,发生凋亡情况与给药剂量呈正相关。3)荧光显微镜下也可观察到,给药6小时后Hep-2细胞的凋亡情况与给药剂量呈正相关。4)在FTY720作用于Hep-2细胞6小时后,利用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测,可明显观察到细胞凋亡的发生。5)利用流式细胞仪可以检测到,给药6小时后一个典型的凋亡峰发生在G2/M期,且凋亡发生率与FTY720剂量呈现正相关。6)分光光度法结果显示,FTY720作用6小时后细胞内有活性的caspase-9的含量明显增加并呈剂量依赖性。结论:1.FTY720对Hep-2,Hela,A549,SMMC-7721细胞的增殖有明显的抑制作用,并且呈剂量相关性。对不同肿瘤细胞系的敏感性也不相同。2.FTY720抗Hep-2细胞的增殖可能是通过诱导细胞凋亡而进行的。3.FTY720诱导Hep-2细胞凋亡主要作用于细胞的G2/M期。4.FTY720诱导Hep-2细胞凋亡与它可以激活细胞内caspse-9,使凋亡相关蛋白caspase-9活性增高有关。