土壤微生物转化三七茎叶资源化利用的研究

论文摘要

植物资源的综合开发利用,是指充分利用植物地下和地上部分,防止不必要的浪费,或者对同种植物资源进行多方面、多层次的开发利用。植物三七由于其具有多种药理活性,受到广泛重视及大力开发,但其开发与加工主要集中于传统入药部位三七根、根茎,三七茎叶通常作为废物被丢弃,每年的利用率不足其产量的5%,因此对三七茎叶的研究与应用是自然资源的综合开发利用与社会发展相适应的必然要求,通过“绿色、环保”的生物转化法从废弃物三七茎叶中获得对人类健康有益的防治恶性疾病的生物活性物质,则具有重要的环境、医学和经济价值。从种植人参的土壤中共分离获得127株菌株,其中对三七茎叶转化活性最强的菌株为一株甘蔗镰孢菌。培养实验表明：培养基初始pH值5～6、装液量20mL/100mL、培养温度30℃、摇床转速160 rpm、培养36～48h为甘蔗镰孢菌的最佳培养条件。三七茎叶经甘蔗镰孢菌转化可获得活性较高的产物,转化产物经硅胶柱层析法和制备液相法分离,并通过理化常数对比和光谱数据分析,发现其中含有稀有活性人参皂苷Compound-Mx、Ginsenoside-Mc和Compound-K。通过转化温度、转化时间等单因子实验和正交优化表明：3种产物的总产量在转化温度30℃、培养基pH值5.5、底物加入量45mg,转化6d时获得最大,在总产物中大于80%,其中G-Mc的含量比三七茎叶中的原含量提高80倍,C-K的含量提高215倍,而C-Mx为非天然产物,在人参、西洋参及三七各部分中均不存在。通过单体皂苷转化实验证实3种转化产物分别是由三七茎叶中的原型皂苷Rb3、Rc和Rbl转化而来,转化途径为：Rb3→Gy-Ⅸ→C→Mx；Rc→Fe→G-Mc；C-K的产生是由两部分组成,大部分由Rb1→Rd→F2→C-K,另一小部分是G-Mc被进一步转化产生。通过荷瘤小鼠体内抗肿瘤实验证实,三七茎叶只经一步转化即可使其主要成分的抗肿瘤活性提高2.3倍,达75.7%,明显高于目前临床使用的一线抗肿瘤药物紫杉醇（55.3%）及已经上市的国家一类新药人参皂苷Rg3（58.5%）,可见甘蔗镰孢转化产物有望开发成为抗肿瘤的特效新药。本研究中采用的甘蔗镰孢转化法与传统的酸、碱水解法相比,具有反应条件温和、工艺简单、无三废排放及不浪费资源等优势,与酶转化法相比,产物C-K的产量是常用酶制剂β-葡聚糖苷酶的2.3倍,纤维素酶的3倍,转化成本却不及酶法的1/100。由此可见,采用该法综合利用废弃物三七茎叶具有广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 三七茎叶的应用与主要活性成分的研究现状
• 1.1.1 三七种植业的发展趋势及三七茎叶的应用现状
• 1.1.2 三七茎叶中活性成分的研究现状
• 1.2 人参皂苷的糖链及糖苷键的水解方法
• 1.2.1 糖链对生物活性的影响
• 1.2.2 苷键水解的方法
• 1.2.3 不同裂解方法对人体及环境的影响
• 1.3 微生物体系的生物转化技术
• 1.3.1 微生物转化的概念
• 1.3.2 微生物转化的发展概况
• 1.3.3 微生物转化反应的特点
• 1.3.4 影响微生物转化反应的因素
• 1.3.5 微生物转化过程的代谢变化
• 1.3.6 微生物转化技术的环境优势
• 1.4 稀有活性人参皂苷的生物转化
• 1.4.1 已知菌株的微生物转化法
• 1.4.2 活性酶的生物转化
• 1.4.3 肠道菌的代谢
• 1.5 技术路线及主要研究内容
• 第2章 实验材料、仪器与检测方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 药品及试剂
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 三七茎叶主要成分的提取
• 2.2 实验仪器
• 2.3 转化结果的检测方法
• 2.3.1 薄层色谱层析法（TLC）
• 2.3.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 2.4 HPLC检测的方法学考察
• 2.4.1 HPLC检测C-K的方法学考察
• 2.4.2 HPLC检测G-Mc的方法学考察
• 2.4.3 HPLC检测C-Mx的方法学考察
• 第3章 三七茎叶微生物转化菌株的筛选及培养
• 3.1 土壤中微生物转化活性菌株的筛选
• 3.1.1 土壤样品的采集
• 3.1.2 转化菌株的分离、初筛方法
• 3.1.3 转化菌株的初筛结果
• 3.1.4 初筛转化菌种的退化及复壮研究
• 3.2 初筛转化活性菌株培养条件优选
• 3.2.1 霉菌M14的生长条件优选
• 3.2.2 酵母菌A8生长条件的优选
• 3.3 微生物转化活性菌株的复筛
• 3.3.1 转化产物TLC检测结果分析
• 3.3.2 转化产物HPLC检测结果分析
• 3.4 活性菌株的鉴定
• 3.5 小结
• 第4章 提高三七茎叶利用率的微生物转化条件优化
• 4.1 转化产物的成分分析及结构鉴定
• 4.1.1 三七茎叶微生物转化产物的分离
• 4.1.2 转化产物的结构鉴定
• 4.1.3 三七茎叶中主要人参皂苷及转化产物的化学结构
• 4.2 微生物转化条件的优化
• 4.2.1 转化培养基的优选
• 4.2.2 底物加入的时间对转化结果的影响
• 4.2.3 转化时间对转化结果的影响
• 4.2.4 转化温度对转化结果的影响
• 4.2.5 转化培养基初始pH值对转化结果的影响
• 4.2.6 转化底物加入量对转化结果的影响
• 4.2.7 装液量对转化结果的影响
• 4.2.8 摇床转速对转化结果的影响
• 4.2.9 正交实验
• 4.3 微生物转化途径、机理及动力学研究
• 4.3.1 三七茎叶中主要人参皂苷的分离
• 4.3.2 转化途径、机理及动态转化结果
• 4.4 小结
• 第5章 微生物转化法水解人参皂苷糖苷键的优势
• 5.1 三七茎叶的酸水解
• 5.1.1 试剂的配制及实验方法
• 5.1.2 实验结果
• 5.2 三七茎叶的碱水解
• 5.2.1 实验方法
• 5.2.2 实验结果
• 5.3 三七茎叶的生物转化
• 5.3.1 三七茎叶的酶转化
• 5.3.2 酶转化与F.sacchari转化结果比较
• 5.4 反应机理及转化产物比较
• 5.5 小结
• 第6章 三七茎叶转化总产物的生物活性及药用价值
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 实验动物的生存环境
• 6.1.2 实验药品的配制
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 给药方式
• 6.2.2 实验数据处理方法
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 抗肿瘤实验结果
• 6.3.2 药物对免疫器官的影响
• 6.4 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文及获奖情况
• 附图